USP18 (D4E7) Кролячий mAb # 4813

Вестерн-блот-аналіз екстрактів з клітин THP-1, необроблених або оброблених LPS (1 мкг/мл, 24 години), з використанням USP18 (D4E7) кролячих mAb.

Імунопреципітація USP18 з екстрактів THP-1, оброблених TPA (12-O-тетрадеканоїлфорбол-13-ацетат) # 4174 (80 нМ протягом ночі) та ліпополісахаридів (LPS) # 14011 (1 мкг/мл протягом ночі). Доріжка 1 - це 10% введення, доріжка 2 - це USP18 (D4E7) кролиць mAb, а смуга 3 - це кролик (DA1E) mAb IgG XP ® Isotype Control # 3900. Вестерн-блот-аналіз проводили за допомогою USP18 (D4E7) кролячого mAb. Анти-кролячий IgG, зв'язане з HRP антитіло # 7074 використовували як вторинне антитіло.

USP18 (D4E7) Кролячий mAb 4813

Імунопреципітація USP18 з екстрактів THP-1, оброблених TPA (12-O-тетрадеканоїлфорбол-13-ацетат) # 4174 (80 нМ протягом ночі) та ліпополісахаридів (LPS) # 14011 (1 мкг/мл протягом ночі). Доріжка 1 - це 10% вхідних даних, доріжка 2 - USP18 (D4E7) кролячий mAb, а смуга 3 - кролячий (DA1E) mAb IgG XP ® Isotype Control # 3900. Вестерн-блот-аналіз проводили, використовуючи USP18 (D4E7) кролячий mAb. Анти-кролячий IgG, зв'язане з HRP антитіло # 7074 використовували як вторинне антитіло.

Ваш місцевий представник
Ваша інформація про місцеві покупки
Гарантія антитіл
FAQ
Технічна підтримка

Супровідні дані
Супутні товари
Використання продукту
Протоколи
Передумови
Шляхи та білки
Цитати та відгуки

Супровідні дані

РЕАКТИВНІСТЬ	H
ЧУТЛИВІСТЬ	Ендогенні
МВт (кДа)	34, 39
Джерело/Ізотип	Кролячий IgG

Ключ програми:

W-Західний
IP-Імунопреципітація
IHC-Імуногістохімія
ЧІП-Імунопреципітація хроматину
ЯКЩО-Імунофлюоресценція
F-Проточна цитометрія
E-P-ІФА-пептид

Ключ перехресної реактивності виду:

H-Людина
М-Миша
Р.-Щур
Хм-Хом'як
Mk-Мавпа
Мі-Норка
C.-Курка
Дм-D. melanogaster
X-Ксенопус
Z-Данио
B-Бичачий
Dg-Пес
Стор-Свиня
Доктор-S. cerevisiae
Се-C. elegans
Хр-Кінь
Всі-Очікуються всі види

ISG15 Антитіло # 2743

Фосфо-Stat1 (Tyr701) (58D6) Кролячий mAb # 9167

ISG15 (22D2) Кролячий mAb # 2758

Stat1 (9H2) Миша mAb # 9176

Антитіло Stat1 # 9172

Stat2 (D9J7L) Кролячий mAb # 72604

FastScan ™ Phospho-Stat1 (Tyr701) ELISA Kit # 40716

Фосфо-Stat2 (Tyr690) (D3P2P) Кролячий mAb # 88410

Rig-I (D14G6) Кролячий mAb # 3743

Stat1 (D1K9Y) Кролячий mAb # 14994

Інформація про використання продукту

Розведення для застосування

Вестерн-блотинг	1: 1000
Імунопреципітація	1:50

Зберігання

Поставляється в 10 мМ HEPES натрію (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 100 мкг/мл BSA, 50% гліцерину та менше 0,02% азиду натрію. Зберігати при –20 ° C. Не аліквотуйте антитіло.

Протокол

Вестерн-протокол промокання

Для вестерн-блоттингу інкубуйте мембрану з розведеним первинним антитілом у 5% мас./Об. BSA, 1X TBS, 0,1% Tween ® 20 при 4 ° C з легким струшуванням протягом ночі.

ПРИМІТКА: Будь ласка, зверніться до веб-сторінки первинного продукту антитіл щодо рекомендованого розведення антитіл.

А. Розчини та реагенти

Від підготовки зразка до виявлення, реагенти, необхідні для вашого Western Blot, тепер знаходяться в одному зручному наборі: # 12957 Western Blotting Application Solutions Kit

ПРИМІТКА: Приготувати розчини з деіонізованою зворотним осмосом (RODI) або рівноцінною водою.

B. Зміщення білків

Загальний протокол підготовки зразків.

Обробляйте клітини, додаючи свіжий носій, що містить регулятор протягом бажаного часу.
Аспіратні засоби масової інформації з культур; промити клітини 1X PBS; аспірувати.
Лізують клітини шляхом додавання 1X буфера зразка SDS (100 мкл на лунку 6-лункової пластини або 500 мкл для пластини діаметром 10 см). Негайно зішкребіть клітини з пластини і перенесіть екстракт у пробірку для мікроцентрифуги. Тримайся на льоду.
Ультразвук протягом 10–15 с для завершення лізису клітин та зсуву ДНК (для зменшення в’язкості зразка).
Нагрійте 20 мкл зразка до 95-100 ° C протягом 5 хв; прохолодно на льоду.
Мікроцентрифуга протягом 5 хв.

Завантажте 20 мкл на гель SDS-PAGE (10 см x 10 см).

ПРИМІТКА: Рекомендується завантаження попередньо фарбованих маркерів молекулярної маси (# 13953, 5 мкл/смуга) для перевірки електротрансферу та біотинільованих білкових драбин (# 7727, 10 мкл/смуга) для визначення молекулярних ваг.

Електротрансфер на нітроцелюлозну мембрану (# 12369).

C. Блокування мембрани та інкубації антитіл

ПРИМІТКА: Обсяги для 10 см х 10 см (100 см 2) мембрани; для мембран різного розміру відповідно регулюйте гучність.

I. Блокування мембрани

(Необов’язково) Після перенесення промийте нітроцелюлозну мембрану 25 мл TBS протягом 5 хв при кімнатній температурі.
Інкубуйте мембрану в 25 мл блокуючого буфера протягом 1 години при кімнатній температурі.
Промити три рази по 5 хв по 15 мл TBST.

II. Первинна інкубація антитіл

Інкубуйте мембрану та первинне антитіло (при відповідному розведенні та розчиннику, як рекомендовано на веб-сторінці продукту) у 10 мл первинного буфера для розведення антитіл, обережно перемішуючи протягом ночі при 4 ° C.
Промити три рази по 5 хв по 15 мл TBST.
Інкубуйте мембрану з анти-кролячим IgG, зв'язаним з HRP антитілом (# 7074 на 1: 2000) та антибіотином, зв'язаним з HRP-антитілом (# 7075 на 1: 1000–1: 3000) для виявлення біотинільованих білкових маркерів у 10 мл блокуючий буфер з легким перемішуванням протягом 1 години при кімнатній температурі.
Промити три рази по 5 хв по 15 мл TBST.
Продовжуйте виявлення (Розділ D).

D. Виявлення білків

Вказівки щодо використання:

Промийте зв’язаний з мембраною HRP (кон’югат антитіл) тричі протягом 5 хвилин у TBST.
Приготуйте 1X реагенту SignalFire ™ ECL (# 6883), розбавивши одну частину 2X реагенту A та одну частину 2X реагенту B (наприклад, для 10 мл додайте 5 мл реагенту A та 5 мл реагенту B). Добре перемішати.
Інкубуйте субстрат з мембраною протягом 1 хвилини, видаліть надлишок розчину (мембрана залишається вологою), оберніть пластиком і піддайте рентгенівській плівці.

* Уникайте повторного впливу на шкіру.

розміщено в червні 2005 року

переглянуто в червні 2020 року

Імунопреципітація природних білків

Цей протокол призначений для імунопреципітації природних білків для аналізу за допомогою активності західного імуноблоту або кінази з використанням магнітного розділення білка А.

А. Розчини та реагенти

ПРИМІТКА: Приготувати розчини з деіонізованою зворотним осмосом (RODI) або рівноцінною водою.

20-кратний сольовий розчин, забуференний фосфатом (PBS)

10X буфер для лізису клітин: (# 9803) Для приготування 10 мл 1Х буфера лізису клітин додайте 1 мл буфера лізису клітин до 9 мл dH2O, змішайте.

ПРИМІТКА: Додайте 1 мМ PMSF (# 8553) безпосередньо перед використанням.

3X буфер зразків SDS: Синій завантажувальний пакет (# 7722) або Червоний завантажувальний пакет (# 7723) Підготуйте свіжий 3-кратний буфер завантаження, додавши 1/10 об'єму 30X DTT до 1 об'єму 3X буфера завантаження SDS.

Білок А Магнітні намистини: (# 73778).

Магнітна сепараційна стійка: (# 7017) або (# 14654).

10X буфер кінази (для аналізів на кіназу): (# 9802) Для приготування 1 мл 1Х кіназного буфера додайте 100 мкл 10Х кіназного буфера до 900 мкл dH2O, змішайте.

АТФ (10 мМ) (для аналізів на кіназу): (# 9804) Для приготування 0,5 мл АТФ (200 мкМ) додайте 10 мкл АТФ (10 мМ) до 490 мкл 1Х кіназного буфера.

B. Приготування клітинних лізатів

Аспіратні засоби масової інформації. Обробляйте клітини, додаючи свіжий носій, що містить регулятор протягом бажаного часу.
Щоб зібрати клітини в умовах, що не відрізняються від природи, видаліть середовище та промийте клітини один раз холодним 1X PBS.
Видаліть PBS і додайте 0,5 мл холодного 1X буфера лізису клітин на кожну пластину (10 см) та інкубуйте на льоду протягом 5 хв.
Зішкніть клітини з пластини і перенесіть їх у пробірки для мікроцентрифуги. Тримайся на льоду.
Ультразвукова обробка на льоду тричі по 5 сек. Кожна.
Мікроцентрифугують протягом 10 хв при 4 ° С, 14000 х г і переносять супернатант в нову пробірку. Супернатант - це клітинний лізат. При необхідності лізат можна зберігати при -80 ° C.

C. Імунопреципітація

Попереднє очищення клітинного лізату (необов’язково)

Настійно рекомендується попередньо очистити клітинний лізат, щоб зменшити неспецифічне зв’язування білка з білками магнітного білка А. Попередньо очистіть достатньо лізату для тестових зразків та контролю ізотипу.

ВАЖЛИВО: Попередньо вимийте # 73778 магнітні кульки безпосередньо перед використанням:

Перенесіть 20 мкл суспензії з бісеру в чисту пробірку. Помістіть трубку в магнітну сепараційну стійку на 10-15 секунд.

Обережно видаліть буфер, як тільки розчин стане прозорим. Додайте 500 мкл 1Х буфера лізису клітин до гранул магнітних гранул, ненадовго перемішайте на вихорі, щоб промити кульки. Помістіть трубку назад у магнітну сепараційну стійку. Видаліть буфер, як тільки розчин очиститься. Повторіть крок миття ще раз.

Додайте 200 мкл клітинного лізату до 20 мкл попередньо промитих магнітних гранул.

ВАЖЛИВО: Оптимальна концентрація лізату буде залежати від рівня експресії цікавого білка. Рекомендована початкова концентрація від 250 мкг/мл до 1,0 мг/мл.

Інкубуйте з обертанням протягом 20 хвилин при кімнатній температурі.

Відокремте кульки від лізату за допомогою магнітної стійки, перенесіть попередньо очищений лізат у чисту пробірку та відкиньте гранулу з магнітними кульками.

Перейдіть до розділу імунопреципітації.

Імунопреципітація

ВАЖЛИВО: Настійно рекомендується відповідний контроль ізотипу, щоб показати специфічне зв'язування у вашому первинному імунопреципітації антитіл. Використовуйте звичайний кролячий IgG # 2729 для кролячих поліклональних первинних антитіл, кролячий (DA1E) mAb IgG XP ® Isotype Control # 3900 для моноклональних первинних антитіл кролика та мишачий (G3A1) mAb IgG1 контрольний антитіла # 5415 для моноклональних первинних антитіл. Контроль над ізотипом повинен відповідати концентрації та проводитись поряд із зразками первинних антитіл

Додайте первинне антитіло (у відповідному розведенні, як рекомендовано в технічному паспорті продукту) до 200 мкл лізату клітин. Інкубуйте з обертанням протягом ночі при 4 ° C. для формування імунокомплексу.
Попередньо промийте магнітні кульки (див. Розділ попереднього очищення клітинного лізату, кроки 1 і 2).
Перенесіть розчин лізату та антитіла (імунокомплекс) у пробірку, що містить попередньо промиту гранулу з магнітних гранул.
Інкубуйте з обертанням протягом 20 хв при кімнатній температурі.
Гранули з гранул з використанням магнітної стійки. Промийте гранули п'ять разів 500 мкл 1Х буфера лізису клітин. Тримайте на льоду між праннями.
Перейдіть до аналізу на західну імуноблотинг або кіназну активність (розділ D).

D. Аналіз зразків

Перейдіть до одного з наступних конкретних кроків.

Для аналізу методом Вестерн-Імуноблотінгу

Ресуспендуйте гранулу з 20-40 мкл 3X буфера зразка SDS, ненадовго перемішайте на вихорі, щоб перемішати, і короткочасно мікроцентріфугуйте, щоб осадити зразок.
Нагрійте зразок до 95-100 ° C протягом 5 хв.
Гранули з гранул за допомогою магнітної стійки. Переносять супернатант в нову пробірку. Супернатант - це зразок.
Проаналізуйте зразок вестерн-блот (див. Вестерн-протокол імуноблотінгу).

ПРИМІТКА: Звести до мінімуму маскування, спричинене денатурованими важкими ланцюгами IgG (

50 кДа), ми рекомендуємо використовувати mAb проти кролячого IgG (специфічно для легкої ланцюга) (D4W3E) (# 45262) або mAb проти кролячого IgG (специфічне для конформації) (L27A9) (# 3678) (або кон'югат HRP №5127 ). Щоб мінімізувати маскування, спричинене денатурованими легкими ланцюгами IgG (

25 кДа), ми рекомендуємо використовувати мишачий анти-кролячий IgG (специфічний для конформації) (L27A9) mAb (# 3678) (або кон'югат HRP # 5127).

Для аналізу за допомогою аналізу кінази

Промийте гранули двічі 500 мкл 1Х буфера кінази. Тримайся на льоду.
Суспендирують гранули в 40 мкл 1Х кіназного буфера, доповненого 200 мкМ АТФ і відповідним субстратом.
Інкубуйте протягом 30 хв при 30 ° C.
Завершують реакцію 20 мкл 3X буфера зразка SDS. Вихри, потім мікроцентрифуга протягом 30 сек.
Переносять супернатант, що містить фосфорильований субстрат, в іншу пробірку.
Нагрійте зразок до 95-100 ° C протягом 2-5 хв і мікроцентрифугуйте протягом 1 хв при 14000 х g.
Завантажте зразок (15-30 мкл) на гель SDS-PAGE.

розміщено в грудні 2008 року

переглянуто в квітні 2018 року

Ідентифікатор протоколу: 410

Специфічність/Чутливість

USP18 (D4E7) Кролячий mAb виявляє ендогенні рівні загального білка USP18. Смуга дублетів, виявлена вестерн-блот, представляє повну довжину (39 кДа) та аміно-кінцеву видалену похідну USP18 (8).

Видова реактивність:

Джерело/Очищення

Моноклональні антитіла отримують імунізацією тварин синтетичним пептидом, що відповідає залишкам, що оточують Pro45 людського білка USP18.

Передумови

Убіквітуючі ферменти (UBE) каталізують убіквітінацію білка - оборотний процес, протидіяний дії деубіквітуючого ферменту (DUB). Визнано п’ять підсімейств DUB, включаючи ферменти USP, UCH, OTU, MJD та JAMM (1,2). USP18 (також відомий як UBP43) - деубіквітиназа, найбільш відома каталізатором видалення ISG15, регульованого інтерфероном убібіквітин-подібного білка, з кон’югованих білків (3). Видалення ISG15 з цільових білків пептидазою USP18 підтримує критичний клітинний баланс кон'югованих з ISG15 білків, важливих для нормального розвитку та роботи мозку (4,5). Після індукції IFN або LPS (6) USP18 пов'язує субодиницю рецептора INF IFNAR2 та інгібує передачу сигналу через шлях JAK-STAT (7). Регулювання USP18 сигналізації IFN інгібує опосередкований IFN апоптоз і не обов'язково покладається на активність пептидази USP18 (8). Оскільки терапевтичне використання рекомбінантного ІФН може призвести до рефрактерної передачі сигналів ІФН та менш ефективної відповіді, поєднання лікування ІФН та регулювання експресії USP18 може дати більш позитивний результат (9).

Шляхи та білки

Дослідіть шляхи + білки, пов’язані з цим продуктом.