Вплив вмісту жирних кислот у харчуванні на плечовий хрящ та структуру кісток на мишачій моделі ожиріння, спричиненого дієтою

Лорен Вотава

1 Кафедра ортопедичної хірургії, Університет Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі 63110

2 дитячі лікарні - Shriners - Сент-Луїс, Сент-Луїс, MO 63110

3 Кафедра біомедичної інженерії, Вашингтонський університет, Сент-Луїс, штат Міссурі 63110

Андреа Г. Шварц

1 Кафедра ортопедичної хірургії, Вашингтонський університет, Сент-Луїс, Міссурі 63110

2 дитячі лікарні - Shriners - Сент-Луїс, Сент-Луїс, MO 63110

Наталя Сергіївна Гарасимович

1 Кафедра ортопедичної хірургії, Вашингтонський університет, Сент-Луїс, Міссурі 63110

2 дитячі лікарні - Shriners - Сент-Луїс, Сент-Луїс, MO 63110

Чіа-Лун Ву

1 Кафедра ортопедичної хірургії, Університет Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі 63110

2 дитячі лікарні - Shriners - Сент-Луїс, Сент-Луїс, MO 63110

Фаршид Гілак

1 Кафедра ортопедичної хірургії, Університет Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі 63110

2 дитячі лікарні - Shriners - Сент-Луїс, Сент-Луїс, MO 63110

3 Кафедра біомедичної інженерії, Вашингтонський університет, Сент-Луїс, штат Міссурі 63110

Внески автора: LV та FG розробили концепцію та розробили експерименти. Л. В. проводила експерименти. LV, AGS, NSH та CLW аналізували дані. Л. В. написав рукопис. Усі автори прочитали та схвалили остаточно поданий рукопис.

Анотація

ВСТУП

Для більш прямого вивчення механізмів, що зв’язують ожиріння та ОА, розроблені тваринні моделі ожиріння, що використовують або дієту з високим вмістом жиру 10–14, або генетичну абляцію сигналів про лептин (наприклад, мишей ob/ob або db/db). 15 Багаточисельні дослідження показали посилення тяжкості спонтанного ОА 15–17 або індукованого ОА 7,13,14 у тварин, що харчуються дієтою з високим вмістом жиру, але відсутність спонтанного ОА у мишей із ожирінням та дефіцитом лептину, які харчуються стандартною дієтою чау-чау . 15

Також є все більше доказів того, що дієтичний склад сам по собі може сприяти ОА, спричиненому ожирінням. На додаток до калорійності, є все більше доказів того, що склад раціону, зокрема вміст жирних кислот, може суттєво впливати на тяжкість ОА в суглобовій специфіці. 7,10,18,19 Наприклад, дієти з високим вмістом жиру, складені переважно насиченими жирними кислотами (SFA) або поліненасиченими жирними кислотами ω-6 (PUFA), демонструють значно гірший ОА колінного суглоба, ніж аналоги, які відповідають вазі. жирна дієта з ω-3 ПНЖК або звичайна дієта для чау-миші. 10 У цих дослідженнях було виявлено, що дієта з високим вмістом жиру, доповнена ω-3 ПНЖК, захищає коліно від ОА, спричинених травмами, тоді як дієти з високим вмістом жиру, багаті насиченими жирами та ω-6 ПНЖК, посилюють дегенерацію хряща та синовіт після травми коліна. Однак не спостерігається значного впливу підвищеного вмісту в їжі ω-3 ПНЖК на розвиток спонтанного ОА в колінному суглобі. 7,10,20

Метою цього дослідження було визначити, чи впливав вміст жирних кислот у харчуванні на виникнення спонтанних ОА та структурних змін кісток плеча у мишей із ожирінням, спричинених дієтою. Мишей годували або нежирною контрольною дієтою чау, або дієтами з високим вмістом жиру, багатими ω-3 ПНЖК, ω-6 ПНЖК або SFA. Ми припустили, що дієта, багата на PUFA ω-3, матиме захисний ефект на хрящі та кістки плеча. Кістку, хрящ та синовію головки плечової кістки аналізували на наявність пов’язаних з ОА змін за допомогою мікро-комп’ютерної томографії (MicroCT) для вивчення мікроструктури кісток, атомно-силової мікроскопії (AFM) для вивчення механічних властивостей мікромасштабу хряща та гістологічного класифікації до оцінити дегенерацію хряща та синовіальне запалення.

МЕТОДИ

Тварина модель.

Починаючи з 4-тижневого віку, самців мишей C57BL/6J годували протягом 24 тижнів або контрольною дієтою з низьким вмістом жиру (10% ккал жиру), або однією з трьох дієт з високим вмістом жиру (60% ккал жиру), багатих ω-3 ПНЖК, ω-6 ПНЖК або SFA . Ці миші були спочатку розроблені для попереднього дослідження, що досліджувало, як дієтичні жирні кислоти впливають на розвиток ОА коліна, і були повідомлені дані про вміст у їжі, вагу тіла, тяжкість ОА коліна, вимірювання цитокінів та ліпідів у сироватці крові та відповідь на загоєння рани у вусі. 7,10 Таким чином, у цьому дослідженні не використовувались живі тварини, але всі попередні процедури використання тварин були затверджені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин. 7,10 Усі зразки зберігали при -20 ° C після евтаназії. Перед аналізом зразки розморожували при 4˚С, а голови плечової кістки ізолювали.

Аналіз MicroCT трабекулярної та коркової кісток.

Гомілкові голівки фіксували у 4% параформальдегіді протягом 24 годин при кімнатній температурі (n = 12-15 на групу дієти). Потім зразки зневоднювали в етанолі та сканували на повітрі за допомогою MicroCT (SkyScan 1176, Bruker, Billerica, MA) з роздільною здатністю 9 мкм/піксель, рентгенівською напругою 55 кВ, струмом 455 мкА, часом витримки 980 мс, 3-кратним середнім значенням кадру, а також промінна фільтрація з алюмінієвим фільтром 0,5 мм. Мінеральну щільність кісток калібрували за допомогою фантомів гідроксиапатиту (Bruker). Трабекулярні ділянки головки плечової кістки визначали як обсяг між субхондральною кістковою пластинкою та проксимальною пластиною росту. Кожну область аналізували за допомогою розширення BoneJ у ImageJ. Обчислювали об'ємну частку трабекулярної кістки (BV/TV), товщину трабекули (Tb.Th.) та трабекулярне розділення (Tb.Sp.). Кісткові ділянки кори аналізували за допомогою автоматизованого програмного пакету CTan (Bruker). Площу поперечного перерізу і товщину кіркової кістки розраховували з 20 зрізів, розташованих у двох діафізарних областях: 0,5 мм від дистального відділу головки плечової кістки і в дистальному аспекті дельтоподібної горбистості (n = 6-14).

Атомно-силова мікроскопія.

Механічне випробування властивостей мікромасштабу хряща проводили за допомогою АСМ, як описано раніше. 28,30 Коротко кажучи, щойно розсічені головки плечової кістки були вбудовані в середовище оптимальної температури різання (OCT), і були отримані кріосекції суглобового хряща головки плечової кістки товщиною 5 мкм. Зрізи ненадовго розморожували та імунологічно фарбували на колаген VI як маркер PCM. Коротко, зрізи промивали у PBS, блокували у 10% нормальній козячій сироватці та інкубували з афінним очищеним кролячим поліклональним колагеном типу VI антитіл (Fitzgerald Industries, Acton, MA), розведеним 1: 200 у розчині блокування протягом 1 години. Зрізи промивали PBS і фарбували кон’югованим козячим анти-кролячим антитілом AlexaFluor 488, розведеним при 1: 200 в блокувальному розчині (Abcam, Cambridge, MA). Зрізи витримували в PBS до аналізу для збереження гідратації. Місцевий механічний модуль розраховували за допомогою AFM (MFP-3D, Asylum Research, Санта-Барбара, Каліфорнія). Хрящову тканину досліджували за допомогою кремнієвої консолі (k

5,4 Н/м; Novascan Technologies, Ames, IA) із боросилікатним сферичним індентором діаметром 5 мкм, який калібрували щодня. Регіони інтересів, що охоплюють один хондроцит, були ідентифіковані за допомогою флуоресцентної мікроскопії і розташовані приблизно на 1-2 клітини від зовнішніх країв зрізів, щоб уникнути крайових артефактів, залишаючись поза глибокозоновим хрящем і субхондральної кісткою. Область аналізу AFM становила 10 мкм 2, а відступ проводили кожні 0,5 мкм, щоб отримати загальну кількість 400 відступів на область. Зразок був вдавлений із швидкістю 10 мкм/с, оскільки попередні дослідження показали незначні або зовсім не змінювали значення модулів для швидкостей відступу між 5 і 25 мкм/с. 31 Відступ продовжували, поки не було досягнуто зусилля спрацьовування, 300 нН.

Консольне відхилення та рух z-п'єзозапису було записано для кожного місця з відступами за допомогою програмного забезпечення Asylum Research та проаналізовано за допомогою спеціального сценарію MATLAB (The MathWorks, Natick, MA). Модуль пружності тканини визначали за допомогою модифікованої моделі Герца, як описано раніше. 28,31–33 Екстраполяція точки контакту була використана для визначення точки, в якій консоль контактувала з поверхнею. Зображення флуоресценції накладали на карти жорсткості, щоб ідентифікувати кожне місце вдавлення як ECM або PCM. Точки аналізу всередині клітинного тіла були виключені з подальшого аналізу. Точки даних також виключались, якщо вони перевищували в 2,5 рази середнє значення навколишніх значень; у цьому випадку їх замінили середнім значенням сусідніх точок. Для побудови модуля в залежності від відстані від центру клітини флуоресцентне зображення кожної області клітини було пороговим у MATLAB, і середні модулі були розраховані для кожного кільця товщиною 0,5 мкм, визначеного радіально, починаючи з краю комірки. Через високу щільність хондроцитів у мишачому хрящі середній модуль був усічений до максимального значення, щоб уникнути включення областей PCM із сусідніх хондроцитів.

Гістологічний аналіз та оцінка.

Гомілкові головки фіксували у 4% параформальдегіді, декальцинували за допомогою Calex II (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) та вкладали у парафін. Зразки розділяли на 8 мкм і фарбували за допомогою сафраніну-О, швидкого зеленого та гематоксиліну для класифікації ОА або гематоксиліну та еозину для класифікації синовіту. Фенотип хряща оцінювали за допомогою модифікованої системи оцінки Манкіна двома засліпленими особами. 7,13 Дана оцінка складалася з наступних категорій: структура поверхні хряща (0-11), дублювання тима (0-3), фарбування Сафранін-О (0-8), клони хондроцитів у некальцинованому хрящі (0-2), гіпертрофічні хондроцити в кальцифікованому хрящі (0-2) та товщині субхондральної кістки (0-2). Загальна кількість балів становила 28. Синовіальне запалення оцінювалося двома засліпленими балами, використовуючи встановлену бальну систему. 13 Це складалося з наступних категорій: збільшення шару клітини синовіальної оболонки (0-3) та щільність клітин синовіальної оболонки (0-3). Товщину не кальцинованого та кальцифікованого хряща та субхондральної пластинки визначали за допомогою репрезентативних гістологічних зображень. В середньому було проведено п’ять вимірювань товщини для кожного з’єднання.

Статистичний аналіз.

Значимість між групами дієт для кісток та результатів AFM визначали односторонніми тестами ANOVA та Tukey post hoc. Для дискретних гістологічних оцінок достовірність визначали за допомогою тесту Крускала-Уолліса. Дані представлені як середнє значення ± стандартна похибка середнього значення (SEM). Вибіги визначали за допомогою тесту ROUT (Q = 1%). Усі статистичні дані проводились у Prism 7.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

РЕЗУЛЬТАТИ

Аналіз MicroCT епіфізарної області плечової кістки (малюнок 1A) не показав впливу дієтичного складу жирних кислот на МЩКТ (малюнок 1B) або Tb.Th (малюнок 1D). Об'ємна частка кісток BV/TV (рис. 1C) і Tb.Sp (рис. 1E) суттєво відрізнялася між групами дієт. BV/TV значно зменшився як у дієтичних групах ω-6, так і у насичених жирах, тоді як Tb.Sp збільшився лише для групи дієт із насиченими жирами порівняно з контрольною групою дієти.

А) Кронштейн вказує на трабекулярну область, проаналізовану між субхондральною кістковою пластинкою та проксимальною пластиною росту. Вага: 1 мм. Б) Мінеральна щільність трабекулярної кістки (МЩКТ). В) Об'ємна частка кістки, об'єм кістки/загальний об'єм (BV/TV). D) Трабекулярна товщина (Tb.Th). E) Трабекулярне розділення (Tb.Sp). n = 12-15 на групу дієти. Дані представлені як середнє значення ± SEM. Групи, що не мають одного листа, суттєво відрізняються одна від одної, одностороння ANOVA та пост-хок-тест Тукі, p Рисунок 2A). Більш виражені зміни мінеральної щільності кісток можна спостерігати в дистальній ділянці кори, проте в обох регіонах були виявлені суттєві відмінності внаслідок дієти (рис. 2B та and2C). 2С). Цікаво, що дієта з насиченими жирами демонструє нижчу мінеральну щільність кісткової тканини в проксимальній ділянці, але не в дистальній ділянці. У проксимальній області площа лише у групи дієти ω-3 мала зменшення площі (рис. 2D); однак усі дієти з високим вмістом жиру призвели до значного зменшення середньої площі поперечного перерізу в дистальній області відносно стандартних контролів чау (рис. 2Е). Товщина кортикальної частини проксимальної області у групі ω-3 також суттєво зменшилась порівняно з усіма іншими дієтами (рис. 2F), але товщина дистальної області не показала залежності від дієти (рис. 2G).

А) Дужки вказують на дві проаналізовані діафізарні області: проксимальна починається на 0,5 мм нижче кінця головки плечової кістки і має товщину 0,5 мм, дистальна починається після дельтоподібної горбистості і має товщину 0,4 мм. Вага: 1 мм. Мінеральна щільність кісткової тканини (МЩКТ) для B) проксимальної та C) дистальної. Середня площа перерізу для D) проксимального та E) дистального. Товщина кори для F) проксимальна та G) дистальна. Дані представлені як середнє значення ± SEM. Групи, які не мають одного листа, суттєво відрізняються одна від одної, односторонній ANOVA та пост-хок-тест Тукі, p Рисунок 3A) не показали значних змін у значеннях модуля хряща як для основного ECM, так і для PCM, що оточує хондроцит (рис. 3С). Прогресування модуля з більш м'якого РСМ на більш жорсткий ЕКМ не було суттєво зміненим раціоном, хоча миші, що харчувалися раціоном SFA, демонстрували тенденцію до зменшення модуля (рис. 3D). Репрезентативна карта жорсткості (Малюнок 3B) показує більш м'який PCM, що оточує клітину, і поступовий прогрес до більш жорсткого ECM.

А) Флуоресцентне зображення досліджуваної області. Червона крапка вказує на початкове місце розташування зонда AFM, блакитна стрілка зі стрілками вказує область та напрямок сканування зонда. Шкала шкали: 20 мкм. Б) Репрезентативна карта жорсткості. Кожен піксель представляє одне вимірювання сили для кожної області 0,5 мкм × 0,5 мкм. В) Модуль Янга, усереднений для ECM та PCM. Г) прогресування модуля Янга з клітини в концентричних кільцях 0,5 мкм. Дані представлені як середнє значення ± SEM. Статистично значущих відмінностей не спостерігалося (одностороння ANOVA, p Малюнок 4A, а збільшені зображення поверхні хряща від кожної дієтичної групи показані на Рисунку 4B. Хоча загальний змінений бал Манкіна не показав жодних відмінностей з дієтою (Малюнок 5A), два Підкатегорії варіювались від дієти. Кількість гіпертрофічних хондроцитів у кальцифікованих хрящах (рис. 5В) була значно збільшена у групах ω-6 та насичених жирів порівняно з ω-3 та контрольною дієтою. Також кількість клонів хондроцитів у некальцинованих хрящ (рис. 5С) суттєво зменшився в дієті ω-6 порівняно з усіма іншими групами дієт. Підтвердження відсутнього фенотипу хряща, відповідної товщини не кальцинованих (рис. 5D) та кальцифікованих (рис. 5Е) хрящів також не залежало від дієти Однак товщина субхондральної кісткової пластинки, виміряна за гістологічними зображеннями, суттєво зменшилась при дієті ω-3 порівняно з усіма іншими групами дієт (рис. 5F).

Червоний: протеоглікани, синій: кістки та хрящі. А) Повна голова плечової кістки від миші на контрольній дієті. Шкала шкали: 0,25 мм. Б) Репрезентативні поверхні хряща для кожної дієтичної групи. Шкала: 0,05 мм.

Загальновизнано, що формування та якість кісток можуть, принаймні, частково залежати від рівня активності (тобто потенційного навантаження на скелет) 49. Незважаючи на той факт, що ми не спостерігали значних змін у спонтанній руховій активності у мишей, які харчувались жирними стравами або дієтами, що контролювали чау, у нашій попередній опублікованій роботі 10, залишається незрозумілим, чи є спонтанне пересування оптимальною моделлю для дослідження вагового навантаження на скелет плеча. Щоб вивчити, як рівень активності впливає на якість плечової кістки, майбутні дослідження, можливо, захочуть використовувати поведінкові тести, які більше зосереджені на активності верхніх кінцівок, таких як вертикальне сходження. 50

Ці мінімальні ефекти дієти та ожиріння на структуру хряща підтверджувались результатами того, що наші дієти з високим вмістом жиру не змінювали механічних властивостей PCM та ECM. Раніше ми демонстрували, що зміни як модуля ECM, так і PCM, а також зміна градієнта механічних властивостей від PCM до ECM відображають деградацію матриці в ОА, особливо поблизу окремих хондроцитів. 28 Хоча ці висновки свідчать про те, що плече не є сприйнятливим до ожиріння, спричиненого ОА, відсутність змін макро- або мікромасштабного хряща може бути зумовлена іншими факторами. Наприклад, такі зміни можуть відбуватися довше, ніж 24 тижні на дієті з високим вмістом жиру, і часовий масштаб прогресування захворювання, а також ступінь ураження можуть бути специфічними для суглобів.

Підводячи підсумок, ми спостерігали ряд специфічних для дієти змін кісток через ожиріння, тоді як структура хряща та механічні властивості залишалися відносно незмінними. Дослідження показали специфічні для суглобів різниці у відповіді на ОА, пов’язану з ожирінням, причому кореляція спостерігається в ОА колінного суглоба та кисті, але з незначною або відсутністю кореляції ОА стегна та плеча. 21 Незважаючи на порівняно рідкісну літературу про ОА плеча, наші результати узгоджуються з відсутністю клінічних доказів ожиріння як фактора ризику ОА плеча, але вказують на те, що основні зміни кісток відбуваються в цій моделі. Це дослідження закладає основи для кращого розуміння патогенезу ОА плеча, а також зв'язку між ожирінням та змінами в опорно-руховій тканині плеча. Ця робота надає додаткові обґрунтування для вивчення ролі ожиріння та дієтичного втручання у здоров’ї опорно-рухового апарату, включаючи інші суглоби, такі як плечові, крім колінного та кульшового суглобів.

ПОДЯКИ

Автори дякують Сарі Освальд за надання технічної підтримки рукопису та доктору Келсі Коллінзу за обговорення та допомогу у спільному оцінюванні. Це дослідження було частково підтримано грантами NIH AR50245, AR48852, AG15768, AR48182, AG46927,> AR073752, OD10707,> AR060719, Центром опорно-рухового апарату Університету Вашингтона (NIH P30 AR057235), Фондом артриту та Фондом Ненсі Тейлор з хронічних захворювань Хвороби.