Детермінанти експресії гена жирової тканини людини: вплив дієти, статі, метаболічного стану та Цис Генетична регуляція

Affiliations Inserm, UMR1048, Лабораторія дослідження ожиріння, Команда 4, I2MC, Інститут метаболічних та серцево-судинних захворювань, Тулуза, Франція, Університет Тулузи, UMR1048, Університет Поля Сабатьє, Тулуза, Франція, Відділення харчування та клінічної біохімії, Університетські лікарні Тулузи, Тулуза, Франція

Affiliations Inserm, UMR1048, Лабораторія дослідження ожиріння, Команда 4, I2MC, Інститут метаболічних та серцево-судинних захворювань, Тулуза, Франція, Університет Тулузи, UMR1048, Університет Поля Сабатьє, Тулуза, Франція, GeT, Геном та транскриптомна платформа, GenoToul, Тулуза, Франція

Affiliation SAMM, Statistique, Analyze, Modedisation Multidisciplinaire, Паризький університет 1, Париж, Франція

Affiliations Inserm, UMR1048, Лабораторія дослідження ожиріння, Команда 4, I2MC, Інститут метаболічних та серцево-судинних захворювань, Тулуза, Франція, Університет Тулузи, UMR1048, Університет Поля Сабатьє, Тулуза, Франція, Біоінформаційне плато, I2MC, Інститут метаболічних та серцево-судинних захворювань, Тулуза, Франція

Афілійований відділ харчування, харчових наук, фізіології та токсикології Університету Наварри, Памплона, Іспанія

Партнерський інститут превентивної медицини, лікарні Копенгагенського університету, Копенгаген, Данія

Афілійований відділ харчування людини Факультету наук про життя Університету Копенгагена, Копенгаген, Данія

Affiliation Inserm, U1060, INRA, UMR1235, Ліонський університет, Оллінз, Франція

Інститут кардіометаболізму та харчування (ICAN), лікарня Піті-Сальпер'єр, Париж, Франція, Інсерм, U872, Нутріомія, Науковий центр Кордельє, Париж, Франція, Університет П'єра та Марії Кюрі-Париж 6, Париж, Франція

Філія CEA – Інститут геноміки, Департамент генетики людини, Національний центр генотипування, Еврі, Франція

Інститут досліджень біології, харчування та токсикології людини (NUTRIM), Медичний центр Університету Маастрихта, Маастрихт, Нідерланди

Наталі Вігері,
Емілі Монтастьє,
Жан-Хосе Маоре,
Бальбін Русель,
Маріон Комбс,
Карін Валле,
Наталі Вілла-Віаланей,
Джейсон С. Яковоні,
Ж. Альфредо Мартінес,
Клаус Холст

Цифри

Анотація

Підсумок автора

Цитування: Viguerie N, Montastier E, Maoret J-J, Roussel B, Combes M, Valle C та ін. (2012) Детермінанти експресії гена жирової тканини людини: вплив дієти, статі, стану метаболізму та генетичної регуляції цис. PLoS Genet 8 (9): e1002959. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002959

Редактор: Грег Гібсон, Джорджійський технологічний інститут, Сполучені Штати Америки

Отримано: 20 лютого 2012 р .; Прийнято: 25 липня 2012 р .; Опубліковано: 27 вересня 2012 р

Фінансування: Дослідження було підтримане фінансуванням від Європейських Співтовариств (DiOGenes FP6-513946, MolPAGE LSHG-CT-2004-512066 та ADAPT HEALTH-F2-2008-2011 00), Фондом для наукових досліджень ANR LIPOB та OBELIP та регіону Midi -Піренеї. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Ожиріння характеризується надлишком жиру, що відкладається в жировій тканині (АТ) у вигляді тригліцеридів. Збільшення ожиріння пов’язане з підвищеним ризиком серцево-судинних розладів та метаболічних відхилень, включаючи гіпертонію, резистентність до інсуліну, діабет 2 типу, обструктивне апное сну та рак. Індукована дієтою втрата ваги запобігає ризику діабету 2 типу та метаболічного синдрому [1], [2], підкреслюючи ключову роль АТ у ускладненнях, пов’язаних із ожирінням. Як ключова тканина-мішень при дієтичному втручанні та вузол інтеграції між метаболізмом та імунітетом, адаптації, що відбуваються при АТ, можуть мати глибокий вплив на реакцію всього організму [3], [4].

Випробування DiOGenes - одне з найбільших поздовжніх дієтичних втручань у всьому світі, що складається з 8-тижневої дієти для схуднення та 26-тижневої фази контролю ваги з різними дієтичними режимами [9], [10]. Перспективне довгострокове, рандомізоване, контрольоване дослідження дало унікальну можливість застосувати геномічну технологію до дієтичного втручання, спрямованого на підтримку втрати ваги. У цьому дослідженні ми застосували вдосконалений препарат загальної РНК від AT до тисяч зразків, доступних під час дослідження DiOGenes. За допомогою нової мікрофлюїдної технології було проведено кількісний аналіз експресії генів АТ у осіб з цієї когорти. Досліджено взаємозв'язок між рівнями мРНК та біоклінічними та генетичними даними. Ці інтегративні аналізи дають докази складеного контролю експресії генів АТ за допомогою харчування, метаболічного синдрому, індексу маси тіла (ІМТ), статі та генотипу.

Результати

Оптимізація загальної екстракції РНК та нормалізації експресії генів у жировій тканині людини

Незважаючи на недавній розвиток одноетапних методів, присвячених збагаченим ліпідами зразкам, загальну екстракцію РНК з АТ потрібно було покращити перед застосуванням до аналізу АТ у клінічному дослідженні DiOGenes. Кожен етап загальної екстракції РНК із невеликих кількостей зразків AT людини був оптимізований з метою запобігання втраті дорогоцінних зразків (Таблиця S1, Рисунок S1). У контексті широкомасштабних клінічних програм ми також досліджували, чи може тривале зберігання зразків жиру мати негативний вплив на загальну цілісність РНК. Зразки AT, заморожені в рідкому азоті, можуть зберігатися при -80 ° C до 3 років, не впливаючи на загальний вихід РНК (рис. S1) або якість (дані не наведені). Швидке заморожування в рідкому азоті перед зберіганням виявляється таким же ефективним, як замочування зразків у розчинах консервантів. Це критичний момент, оскільки він дозволяє використовувати зразки жиру для інших застосувань, крім транскриптоміки. Для нормалізації даних qPCR в режимі реального часу використовувались різні підходи. Використання простого методу 2 −ΔCt з GUSB як еталонної розшифровки виявилося найкращим для нормалізації підшкірної AT людини (Рисунок S2).

Дослідження DiOGenes

Дієтичне втручання DiOGenes складалося з двох фаз [9], [10]. Першим етапом була 8-тижнева дієта з низьким вмістом калорій (ЖК) з метою втрати ваги на ≥8%. На другому етапі успішних пацієнтів було рандомізовано на одну з п’яти дієт для підтримання ваги ad libitum (ЗМЗ): чотири дієти, що поєднують високий та низький вміст білка з високим та низьким глікемічним індексом вуглеводів та контрольну дієту відповідно до Національних дієтичних рекомендацій щодо здорових дієти. Клінічні дослідження, включаючи підшкірні мікробіопсії AT, проводили до і в кінці кожної фази.

П’ятьсот шістдесят вісім осіб із ожирінням, віком від 24 до 63 років (середня вага: 99,6 ± 17,1 кг), мали наявні клінічні дані та зразки AT РНК високої якості. Були визначені дві групи пацієнтів (рис. S3). Перша група, група А, включала 311 осіб із ожирінням (107 чоловіків та 204 жінки), дані про експресію генів яких були доступні на кожен день клінічного дослідження. У другій, групі В, було 204 особи з даними про експресію генів, доступними на початковому рівні та після РК. Суб'єкти також класифікувались відповідно до виникнення метаболічного синдрому на початковому рівні [11]. У групі А на початку було 125 метаболічних синдромів та 186 неметаболічних синдромів. Група B мала 81 метаболічний синдром та 123 неметаболічні синдроми на вихідному рівні. Усі вихідні антропометричні та плазмові характеристики описані в таблиці S2. Як у чоловіків, так і у жінок артеріальний тиск, тригліцериди, ЛПВЩ-холестерин, реактивний білок С, адипонектин, глюкоза натще натще і інсулін суттєво відрізнялись при метаболічному синдромі порівняно з неметаболічними синдромами. Крім того, жінки з метаболічним синдромом мали вищу вагу, ІМТ, жирову масу та окружність талії.

Експресія генів жирової тканини регулюється протягом різних фаз дієтичної програми DiOGenes

Кількісну кількісну ПЛР паралельної зворотної транскрипції (RT-qPCR) проводили на AT з дослідження DiOGenes із використанням мікрофлюїдного пристрою qPCR [8]. Дані експресії AT з 271 гена, що представляє інтерес (таблиця S3), досліджували на 1341 зразках від 515 суб'єктів. Гени були відібрані з попередніх опублікованих та неопублікованих аналізів мікрочипів ДНК на обмеженій кількості осіб. Вибір був зроблений з використанням наступних критеріїв: регулювання під час дієтичних програм схуднення [12] - [14], включаючи дослідження DiOGenes [14], та диференціальна експресія за наявністю або відсутністю ожиріння та метаболічного синдрому [15], [ 16]. Сорок відсотків цих генів кодували білки, що беруть участь у метаболізмі, і 23% брали участь в імунній відповіді. Цей список охоплював 38 AT-макрофагів [15], [16] та 84 маркери адипоцитів [12], [15], тобто гени, експресовані у цих типах клітин на значно вищих рівнях, ніж у будь-якому іншому типі клітин AT.

Експресію гена жирової тканини оцінювали на початковому етапі (BAS) та під час дієтичного дослідження, включаючи 8-тижневу низькокалорійну дієту (РК), після чого 26-тижневу дієту для підтримання ваги (ЗМЗ) (чоловіки, чорні квадрати n = 107; жінки, відкриті квадрати n = 204). (‡) Порівняння між БАС та кінцем РК, Р Малюнок 2. Маркери відновлення ваги та втрати ваги жирової тканини під час 26-тижневої дієти для підтримки ваги.

Зміни рівнів мРНК між закінченням низькокалорійної дієти та закінченням 26-тижневої дієти для підтримання ваги порівнювали у жінок, що відновили (відкриті смуги n = 31) або втратили (чорні смуги n = 29) вагу.

Секс, метаболічний синдром та ожиріння впливають на експресію гена жирової тканини

Аналіз основних компонентів даних про експресію генів у суб'єктів групи A та групи B на початковому етапі показав, що основним компонентом, що пояснює розподіл даних про експресію генів AT, була стать. На малюнку S4a зображений частковий найменш квадратно-дискримінантний аналіз генів АТ зі статевою специфічністю. Для переліку генів АТ із висловленою статевою експресією спочатку була побудована модель суміші, що контролює центр, на основі даних групи А. Сто вісімдесят шість генів демонстрували специфіку статі. Потім цю ж модель запускали з даними групи В, даючи список із 158 генів. Статева специфічність для 109 стенограм зберігалася під час дієтичного втручання (таблиця S7). Вища експресія у жіночих АТ була виявлена для всіх генів, за винятком CCL19, який показав вищу експресію у чоловічої АТ (рис. 3). Збільшення жирової маси у жінок, ніж у чоловіків, могло б пояснити цей помітний статевий диморфізм. Однак 88 генів залишалися різними при контролі жирової маси. Лише 5 генів були розміщені на статевих хромосомах (таблиця S7). SAA4, AZGP1, CDKN2C та CES1 були генами з найвищим рейтингом із більш ніж удвічі вищим рівнем експресії у жінок, ніж у чоловіків AT (рис.3).

Чоловіки, відкриті бари (n = 180). Жінки, чорні смуги (n = 323). Показані більшість репрезентативних генів жирової тканини (див. Таблицю S7). Смужки помилок представляють S.E.M.

Дослідницький аналіз експресії гена AT також показав дискримінаційний ефект залежно від наявності або відсутності метаболічного синдрому (рис. S4b). Оскільки клінічна картина метаболічного синдрому різниться у чоловіків і жінок і може, принаймні частково, походити на АТ [16], [17], ми окремо проаналізували 2 популяції для оцінки молекулярних характеристик АТ у пацієнтів з метаболічним синдромом . Підпис метаболічного синдрому був знайдений для 22 генів (таблиця S8). CCL3 та AZGP1 показали удвічі вищу та нижчу експресію відповідно у жінок з метаболічним синдромом порівняно з жінками без метаболічного синдрому (рис. 4). Різниця, хоча і менш виражена, була також у чоловіків.

Експресія гена жирової тканини у людей із ожирінням із (чорними смужками n = 206) та без (відкритими смужками n = 309) метаболічним синдромом (див. Таблицю S8). Смужки помилок представляють S.E.M.

Щоб оцінити внесок ожиріння у експресію генів AT, вплив ІМТ вивчали у чоловіків та жінок окремо на початковому етапі та під час дієтичного втручання. У жінок 51 ген продемонстрував значну залежність ІМТ, яка зберігалася протягом усього дієтичного втручання (таблиця S9). У чоловіків один ген, AZGP1, залежав від ІМТ у кожен момент втручання (дані не наведені).

Функціональні взаємозв’язки жирової тканини людини

Дві мережі залежностей були побудовані з вибраних біоклінічних даних та експресії генів з ліпогенного модуля. Кожен вузол є геном або біоклінічним параметром. Ступінь вузла позначається розміром. Колір вузла вказує на міру центральності середнього значення, яка підраховує, як часто вузол з'являється на найкоротших шляхах між двома іншими вузлами в мережі; червоні вузли - це змінні з великою проміжністю, а зелені - це змінні з низькою проміжком. Центральність між проміжками вказує на вузли, які найімовірніше відключать мережу, якщо їх видалити. Змінні пов’язані ребром, лише якщо їх часткова кореляція є суттєво ненульовою. Товщина краю пропорційна силі кореляції. Колір краю вказує на кореляцію від найбільш позитивного (червоний) до негативного (зелений). (а) Мережа залежностей змін від базового рівня до кінця низькокалорійної дієти. (b) Мережа залежностей змін від вихідного рівня до кінця дієти для підтримки ваги.

Експресія гена жирової тканини людини знаходиться під генетичним контролем за допомогою цис-сигналів

Ми виявили 2953 однонуклеотидні поліморфізми (SNP), які знаходились у безпосередній близькості від 252 генів. На початковому етапі 118 SNP, що представляють 46 генів, продемонстрували зв'язок з експресією гена AT (таблиця S12). Найсильніші асоціації (P −10) були виявлені для ALDOB, MARCO, MMP9 та HLA-A (рис. 6). Чотири SNP, розташовані в інтронічних областях MARCO, який кодує маркер, специфічний для макрофагів AT, регульований ожирінням [15] та дієтичним втручанням (таблиця S5), показали асоціації з P −20. Помірний ефект статі та ІМТ спостерігався для 3 та 13 ОНП відповідно. Однак ці ефекти не узгоджувались серед SNP, які мали значні асоціації з експресією генів AT у відповідних генах. Більшість асоціацій, що спостерігалися на початковому рівні, залишалися значущими при розгляді експресії після РК та ЗМЗ (таблиця S13). Слід зазначити, що жоден SNP не продемонстрував асоціації з індукованими дієтою варіаціями рівнів мРНК (P> 0,5).

Показані більшість репрезентативних генів жирової тканини (див. Таблицю S12). Смужки помилок представляють S.E.M.

Обговорення

Дивлячись на дієтичну програму DiOGenes, основною закономірністю було протилежне регулювання експресії генів АТ між фазами РК та ЗМЗ. Гени, регульовані під час РК та регульовані під час ЗМЗ, були в основному генами адипоцитів, пов'язаними з метаболічними функціями [12]. Найпопулярніші гени, кодовані ферментами, що беруть участь у знежиренні жирних кислот [31]. Відмічена зворотна тенденція щодо генів, пов’язаних з імунітетом. В результаті протилежної регуляції між РК та ЗМЗ, більшість генів мали подібну експресію в кінці втручання порівняно з базовим рівнем. Однак підмножина генів виявила знижену регуляцію наприкінці дієтичного втручання. Список включав кілька генів, які раніше характеризувались як маркери, специфічні для макрофагів AT (CD68, CD163, CD209, IL10, LIPA, MARCO, MS4A4A, PLA2G7, SPP1) [12], [15]. Це скоординоване зниження регуляції, швидше за все, відображає зменшення кількості макрофагів АТ, як це спостерігається при 6-місячному втручанні щодо зниження ваги [32]. Рівні мРНК лептину також були нижчими в кінці дієтичного втручання. Накладання даних LEP та HOMA-IR підтверджує нашу гіпотезу про те, що варіація експресії LEP сприяє покращенню чутливості до інсуліну, яке спостерігається під час схуднення, спричиненого дієтою [3].

Як прототипові приклади, на рівні мРНК ACSL1, ECHDC3 та HSDL2 впливали всі досліджені фактори (рис. 7). SNP виявляли асоціації з рівнями мРНК AT, оскільки кількість дієзміни змінювалася під час дієтичного втручання. Він також відрізнявся залежно від статі та метаболічного синдрому. Дієтичне втручання не змінило статевого диморфізму в експресії генів. ACSL1, який каталізує перетворення довголанцюгових жирних кислот в ацил-КоА, є найбільш поширеною ізоформою ACSL, вираженою в AT. AT-специфічна абляція Acsl1 у мишей показує, що фермент відіграє вирішальну роль у спрямуванні ацил-КоА на β-окислення в жирових клітинах [44]. Тут експресія гена ACSL1 була нижчою у осіб з метаболічним синдромом. Нещодавно повідомлялося про зв'язок між поліморфізмом гена ACSL1 та метаболічним синдромом [45]. Ці дані свідчать про те, що порушення окислення жирових кислот адипоцитів через дефект ACSL1 може становити особливість метаболічного синдрому.