Відмінності експресії генів у жировій тканині, пов’язані з пухлиною грудей

Науково-дослідна робота

Повна стаття
Цифри та дані
Список літератури
Додаткові
Цитати
Метрики
Ліцензування
Передруки та дозволи
PDF

Анотація

Вступ

Дослідження за останнє десятиліття покращили наше розуміння того, як мікросередовище пухлини впливає на розвиток пухлини. Строма молочної залози, яка складає 80% нормальної грудної залози, охоплює фібробласти, ендотеліальні, гладком'язові, запальні та нервові клітини, адипоцити та макромолекули позаклітинного матриксу (ЕКМ) і виконує підтримуючу роль для епітеліальних клітин. 1 Строма зазнає низки фенотипових та функціональних змін, щоб активуватися, забезпечуючи дозвільне середовище для просування клітин епітелію пухлини. 2 Кожен тип клітини строми по-різному сприяє пухлинному розвитку: асоційовані з раком фібробласти виробляють фактори росту, що стимулюють ангіогенез і ріст клітин, підвищена жорсткість ECM полегшує інвазію, а пов'язані з пухлиною макрофаги полегшують міграцію пухлинних клітин, ангіогенез та ремоделювання ECM. 3 Аналіз експресії генів епітеліальних, міоепітеліальних та ендотеліальних клітин, лейкоцитів, міофібробластів та фібробластів із нормальної, протокової карциноми in situ та інвазивних тканин молочної залози виявив диференціальні закономірності експресії генів між нормальною та раковою грудьми в кожному типі клітин. 4

Незважаючи на цей прогрес у розумінні того, як строма сприяє етіології пухлини молочної залози, можлива роль жирової тканини, яка довгий час вважалася функціонувати лише як депо для зберігання інертної енергії, в пухлинному процесі в основному ігнорується. 5 Жирова тканина складається з різноманітного набору типів клітин, включаючи адипоцити, похідні жирових клітин, преадипоцити, лімфоцити, макрофаги, фібробласти та ендотеліальні клітини судин. Дослідження, проведені протягом останнього десятиліття, продемонстрували, що жировий клітин насправді є активним ендокринним органом, що виділяє адипокіни, прозапальні молекули, хемокіни, гормони та фактори росту. 6 В експериментах на спільних культурах та моделях на тваринах було показано, що жирова тканина сприяє розвитку та прогресуванню пухлин молочної залози. 7

Жирова тканина включає

50% грудей людини 8, отже, повного розуміння того, як мікросередовище молочної залози сприяє пухлинному розвитку, неможливо досягти без кращого розуміння того, як жирова тканина може сприяти розвитку та прогресуванню пухлини. Клінічно частота ожиріння зростає в США, збереження грудей залишає позаду потенційно пухлинову жирову тканину, а аутологічний перенос жиру може стимулювати ріст залишкових клітин пухлини, що все призводить до збільшення рецидивів та поганих результатів у хворих на рак молочної залози. З цією метою ми провели аналіз експресії генів на сусідній з пухлиною та віддаленій жировій тканині від інвазивних молочних залоз та на жировій тканині від незлоякісних молочних залоз у жінок у постменопаузі, щоб (1) порівняти експресію генів з жирової тканини від інвазивної та неінвазивної таким чином ідентифікуючи гени, пов'язані з підвищеним ризиком, і (2) порівнювати молекулярні сигнатури жирової тканини, що прилягають до інвазивних пухлин та віддаляються від них, щоб ідентифікувати гени, що активно підтримують розвиток та прогресування пухлини.

Результати

Зразки пацієнтів

Для отримання даних мікрочипів з використанням РНК, виділеної після лазерної мікродисекції, потрібно було отримати мінімальний вихід 1,8 нг та RIN ≥6,0. Кожен із зразків, сусідніх та віддалених, із 30 послідовних пацієнтів у постменопаузі, яким проводили мастектомію з метою інвазивного раку молочної залози, виробляв РНК достатньої кількості та якості для досліджень експресії генів. На відміну від 46 жінок у постменопаузі з незлоякісними діагнозами, 14 зразків генерували РНК недостатнього врожаю і один низької якості, що призвело до 31 придатної для зразка РНК. Більшість пацієнтів з обох груп були самоописані як білі, тоді як більшість не злоякісних пацієнтів були в хірургічному періоді в менопаузі (31%), а менше страждали ожирінням (25%) порівняно з інвазивними пацієнтами (3% та 33% відповідно).

Диференціальна експресія генів у сусідній порівняно з віддаленою жировою тканиною

Коли порівнювали моделі експресії генів із сусідньої та віддаленої жирової тканини з тих самих грудей, 391 ген диференційовано експресувався з 20 генами, що мали ≥2,0-кратну різницю у експресії (таблиця S1). Ймовірність отримати принаймні 391 ген, значущий випадково (на рівні 0,01), якщо не було реальних відмінностей між класами, становила 0,002. Гени з найбільшою різницею кратності включали виділений фосфопротеїн 1 (SPP1), субодиниця рибонуклеотидердуктази М2 (RRM2), матриця металопротеїнази 9 (MMP9) та фосфоліпаза А2, група VII (PLA2G7), кожна з яких була виражена> у 3 рази вище у жировій тканині, що прилягає до порівняно з віддаленою від пухлини. Коли проводився аналіз шляхів, молекулярні шляхи, що залучають імунну систему, включаючи як В-, так і Т-клітинний імунітет, диференційовано регулювались між сусідньою пухлиною та віддаленою жировою тканиною (табл. 1).

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця 1. Диференціально регульовані шляхи BioCarta між парними зразками сусідньої та віддаленої жирової тканини

Диференціальна експресія генів у сусідніх порівняно з незлоякісною жировою кліткою

Порівняння сусідньої з пухлиною жирової тканини та жирової тканини з незлоякісних молочних залоз виявило 928 диференційовано експресованих генів (таблиця S2), 180 з яких продемонстрували ≥2,0-кратні відмінності експресії. Ймовірність отримати принаймні 928 генів, значущих випадково (на рівні 0,01), якщо не було реальних відмінностей між класами, була в 5 разів вищим рівнем у суміжній з пухлиною жировій тканині, тоді як основний комплекс гістосумісності, клас II, DQ-α 1 (HLA-DQA1), основний комплекс гістосумісності, клас II, DQ-β 1 (HLA-DQB1), індукований пролактином білок (PIP), і claudin 8 (CLDN8) були виражені в ≥5-кратному вищому рівні в жировій тканині із злоякісних молочних залоз. Аналіз шляхів виявив, що багато елементів імунітету В і Т-клітин активні в сусідній жировій тканині (Таблиця 2).

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця 2. Шляхи BioCarta зі значною диференціальною експресією між сусіднім та незлоякісним жировим

Диференціальна експресія генів у віддаленому порівняно з не злоякісним жировим

З 562 генів, диференційовано експресованих між віддаленою та незлоякісною жировою тканиною (таблиця S3), 259 (46%) також диференційовано виражені між сусідньою з пухлиною та незлоякісною жировою тканиною, включаючи SPP1, RRM2, MMP9 та PLA2G7, які всі вони виражаються у> 2,0-кратному вищому рівні у віддаленій порівняно з незлоякісною жировою тканиною. Відносні рівні експресії RRM2 між трьома типами жирової тканини показані на малюнку 1. Імовірність отримати принаймні 562 гени, значущих випадково (на рівні 0,01), якщо не було реальних відмінностей між класами, була в 3 рази більшою експресією у віддалена жирова тканина і білок, що зв’язує жирні кислоти 7 (FABP7), E74-подібний фактор 5 (ELF5), міозин зв’язуючий білок С, повільного типу (MYBPC1), матриця металопротеїнази 7 (MMP7), CLDN8, HLA-DQA1, і HLA-DQB1 маючи> 3 рази вищу експресію в не злоякісній жировій тканині. Аналіз шляхів показав, що шляхи, що беруть участь у реплікації ДНК, транскрипції, імунітеті В-клітин та запальній реакції, диференційовано регулюються між жировою тканиною, віддаленою від пухлини молочної залози, та незлоякісною жировою тканиною (таблиця 3).

Опубліковано в Інтернеті:

Фігура 1. Відносний рівень експресії генів RRM2 у сусідній з пухлиною, віддаленій та не злоякісній жировій тканині. Дані отримували методом qRT-ПЛР у 10 парах незалежних зразків сусідньої та віддаленої жирової тканини, а також у дев’яти незалежних зразках незлоякісної жирової тканини. Середні рівні відносної експресії становили 3979 у сусідній з пухлиною, 1428 у віддаленій та 307 у незлоякісній жировій тканині. Блакитні діаманти, сусідня з пухлиною тканина; червоні трикутники, віддалена тканина; зелені трикутники, незлоякісна тканина.

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця 3. Результати порівняння шляхів біокарти між віддаленою та незлоякісною жировою тканиною молочної залози

Обговорення

Важливість мікросередовища пухлини для канцерогенезу була визнана ще в 1944 році, коли Слотер заявив, що "рак виникає не як ізольоване клітинне явище, а як анапластична тенденція, що залучає багато клітин одночасно". 9 Прогресуванню пухлини сприяють стромальні компоненти, такі як фібробласти, ендотеліальні клітини та ECM, які зазнають морфологічних та молекулярних змін для активної підтримки пухлинного генезу. Однак ці зміни не є однорідними по всій грудній клітці, а залежать від близькості до пухлини. Наприклад, ракові клітини індукують окислювальний стрес у сусідніх пов'язаних з раком фібробластах (CAF), що призводить до вироблення поживних речовин, таких як лактат, з CAF, які потім сприяють виживанню ракових клітин; ці ефекти найбільш сконцентровані в сусідніх з пухлиною CAF, але можуть бути в змозі дифундувати до більш віддалених стромальних клітин. 10 Тут ми демонструємо, що профілі експресії генів жирової тканини відрізняються залежно від відстані від пухлини.

Аналіз шляхів припускає, що імунна реакція найвища в сусідній з пухлиною жировій тканині і найнижча в жировій тканині з не злоякісних молочних залоз. Жирова тканина бере участь не тільки в таких процесах, як ендокринна сигналізація, витрата енергії та метаболізм кісток, але також у запаленні та імунітеті. Хоча адипоцити є найбільш поширеним типом клітин, макрофаги містять

10% білої жирової тканини. Адипоцити виділяють різноманітні фактори, які можуть впливати на імунні та запальні реакції, такі як лептин, який є прозапальним, і адипонектин, який є протизапальним. 11 Профілювання експресії генів клітин раку молочної залози MDA-MB-231, культивованих середовищем, культивованим адипоцитами, виявило підвищену експресію генів, що беруть участь у імунній та ранозагоювальній реакції. 12 Ці дані демонструють, що імунна відповідь самої жирової тканини залежить від наявності або близькості до клітин пухлини молочної залози.

Третьою ознакою CAA є знижений вміст ліпідів. Для розмноження пухлинних клітин для поділу потрібні джерело енергії, а також ліпіди для виробництва мембран. Ліполіз сусідніх адипоцитів клітинами епітелію молочної залози відбувається під час лактації 29; це може бути пов’язано з клітинами епітелію пухлини, щоб забезпечити пухлини джерелом енергії. 30 Роль жирової тканини як не тільки палива для росту пухлини, а й у вербуванні макрофагів та стимулюванні запальної реакції може сприяти менш сприятливим результатам пацієнтів із раком молочної залози із ожирінням. Рівні макрофагів жирової тканини були в 3 рази вищими в жировій тканині від ожиріння порівняно з худими особами 31, а редукційні зразки мамопластики у жінок із ожирінням продемонстрували збільшення кількості макрофагів та запальної реакції. 32 Отже, ожиріння може бути фактором ризику раку молочної залози, створюючи запальну реакцію в молочній залозі. У цьому дослідженні 33% інвазивних пацієнтів страждали ожирінням порівняно з 25% пацієнтів з не злоякісними захворюваннями. Відмінності експресії генів та імунотолерантна реакція, що спостерігаються в жировій тканині пацієнтів з інвазивним раком молочної залози, можуть відображати поєднання більш високих показників ожиріння, а також стану захворювання.

Зміни експресії генів у жировій тканині інвазивних молочних залоз можуть вплинути на клінічні результати. Наприклад, останні дані демонструють, що присутність у стромі пухлини асоційованих з пухлиною макрофагів, які мають протизапальну реакцію М2, але не саму пухлину, пов’язано з поганим прогнозом. 33 У пацієнтів, які перебувають на терапії збереження молочної залози (ЗКТ), віддалена жирова тканина, яка може мати імунотолерантний фенотип, буде зберігатися, і підгрупа пацієнтів, у яких БКТ із близькими краями, може містити прилеглу до пухлини жирову тканину із властивостями, що сприяють розвитку пухлини. Таким чином, наявність залишкових пухлинних клітин або повторне засівання молочної залози метастатичними первинними клітинами пухлини молочної залози в пухлинне мікросередовище може сприяти рецидиву.

На закінчення, жирова тканина молочної залози демонструє різні профілі експресії генів в залежності від наявності та близькості до пухлин молочної залози. Змінені імунні відповіді як на сусідню з пухлиною, так і на віддалену жирову тканину від інвазивних молочних залоз порівняно з не злоякісною грудьми дозволяють припустити, що наявність клітин пухлинного епітелію в молочній залозі є достатнім для забезпечення протизапальної реакції по всій грудній залозі. Гени, що експресуються на більш високих рівнях у сусідній з пухлиною жировій тканині, пов’язані зі збільшенням клітинної проліферації, інвазії, міграції, ангіогенезу та метастазування, що дозволяє припустити, що сусідня з пухлиною жирова тканина сприяє росту та прогресуванню пухлини. Ці дані в сукупності дозволяють припустити, що жирова тканина не є інертним компонентом мікросередовища молочної залози, але відіграє активну роль у пухлинному розвитку.

Пацієнти/Методи/Матеріали

Зразки тканин людини

Зарахування пацієнтів до проекту клінічного догляду за грудьми (CBCP) розпочалось у 2001 р. Для включення до CBCP всі пацієнти відповідали наступним критеріям: (1) дорослий віком старше 18 років, (2) психічно компетентний та готовий надати інформовану інформацію згода та (3) надання в центри молочних залоз доказів можливого захворювання молочної залози для проведення планових скринінгових мамографій або планової редукційної мамопластики. Зразки тканин були зібрані з дозволу Комітету з питань людського використання Національного військово-медичного центру імені Уолтера Ріда та Інституційної комісії з огляду. Усі суб'єкти, які навчаються у CBCP, добровільно погодились взяти участь та дали письмову інформовану згоду.

Тканину збирали у пацієнтів, яким проводили хірургічні втручання, включаючи люмпектомію або мастектомію. Протягом 5–15 хв після хірургічного видалення тканину молочної залози доставляли на подрібненому мокрому льоду до патологічної лабораторії, де ліцензований патологоанатом або асистент патолога проводили звичайні аналізи патології (загальна характеристика, оцінка стану та інші зазначені цілі). Надлишки тканин заморожували в середовищі оптимальної температури різання (Sakura Finetek, 4583) на сухому льоду. Після збереження заморожені зразки тканин зберігали в морозильних камерах з рідким азотом.

База даних CBCP була запитана для ідентифікації всіх пацієнтів жіночої статі ≥50 років або хірургічно менопаузи, яким (1) проводили мастектомію інвазивного раку молочної залози або (2) проводили висічення біопсій, що призвело до не злоякісних діагнозів із замороженими зразками, що містять жирову тканину, що прилягає до доброякісне ураження. Незлоякісні діагнози не включали виявлених відхилень, фіброзно-кістозних змін або стромального фіброзу; пацієнти з колонково-клітинними або атиповими гіперплазіями були виключені. Були виключені пацієнти з мутаціями BRCA1 або BRCA2 або мультифокальними або мультицентричними пухлинами, або які проходили неоад'ювантну терапію або мали в анамнезі рак. Для пацієнтів з інвазивним раком молочної залози були включені лише ті зразки, що містять жирову тканину, яка знаходиться безпосередньо поруч з («пухлина, що прилягає») і віддалена («віддалена») від інвазивної пухлини.

Аналіз експресії генів

Для кожного зразка жирової тканини за стандартними процедурами (рис. 2) було зроблено пофарбоване предметне покриття гематоксиліном та еозином (H&E), а потім вирізано 10–20 серійних зрізів (товщиною 10 мкм), встановлених на предметних предметних стеклах з ПЕН-фольги (Leica Microsystems, 11505158), і фарбували за допомогою набору для фарбування LCM (Life Technologies Corporation, AM1935), як описано раніше. 34 За допомогою мікроскопічної оцінки H&E для лазерної мікродисекції були обрані ділянки жирової тканини, вільні від пухлинних або передзлоякісних уражень, судин та інших компонентів строми. Лазерну мікродисекцію проводили за допомогою АСLMD лазерна система мікродисекції. Підготовку слайдів, фарбування та мікродисекцію кожного зрізу проводили протягом 15 хв для збереження цілісності РНК. РНК для аналізу мікрочипів обробляли, як описано раніше. 35 мічених РНК гібридизували з масивами HG U133A 2.0 (Affymetrix, 900469) згідно з протоколами виробника.

Опубліковано в Інтернеті:

Малюнок 2. H&E пофарбовані зображення сусідньої та віддаленої жирової тканини пацієнта з інвазивним раком молочної залози. Зображення зліва - це жирова тканина, що прилягає до ER +/PR -/HER2 -, помірно диференційованої IDCA. Зображення праворуч - віддалена жирова тканина, розташована на відстані 4 см від пухлини.