Причинно-наслідковий зв’язок між гіперфібриногенемією та судинними захворюваннями

  • Розділений екран
  • Поділитися піктограмою Поділіться
    • Facebook
    • Twitter
    • LinkedIn
    • Електронна пошта
  • Значок Інструменти Інструменти

    • Брайс Керлін, Брайан К. Кулі, Беренд Х. Ізерманн, Ірен Ернандес, Рашмі Суд, Марк Зогг, Сара Б. Хендріксон, Майкл В. Моссон, Сьюзен Лорд, Хартмут Вайлер; Причинно-наслідковий зв’язок між гіперфібриногенемією та судинними захворюваннями. Кров 2004; 103 (5): 1728–1734. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2003-08-2886

      судин

      Завантажити файл цитування:

      Анотація

      Підвищений рівень фібриногену у плазмі крові пов’язаний із наявністю серцево-судинних захворювань, але суперечливо: чи підвищений фібриноген спричиняє підвищений ризик, і як такий є справжнім модифікатором серцево-судинних захворювань чи просто пов’язаний із захворюваннями. Досліджуючи трансгенну мишачу модель гіперфібриногенемії, ми показуємо, що підвищена концентрація фібриногену в плазмі крові (1) викликає посилене відкладення фібрину в конкретних органах, (2) взаємодіє з незалежним модифікатором гемостатичної активності для регулювання обміну/відкладення фібрину, (3) посилює неоінтимальну гіперплазія в експериментальній моделі ремоделювання судин, спричиненого стазом, проте (4) може пригнічувати утворення тромбіну у відповідь на виклик прокоагулянтів. Ці висновки дають прямі експериментальні докази того, що гіперфібриногенемія є більше, ніж побічним продуктом серцево-судинних захворювань, і може функціонувати незалежно або інтерактивно для модуляції тяжкості та/або прогресування судинних захворювань.

      Вступ

      Нещодавно описані генетично змінені миші з хронічно підвищеним рівнем фібриногену у плазмі крові за відсутності основного запалення забезпечують новий експериментальний інструмент для дослідження причинно-наслідкових зв'язків між гіперфібриногенемією та судинними захворюваннями. 18 Мутантний штам миші (надалі іменуваний мишами Hifib) був отриманий шляхом мікроін'єкції пронуклеарних ооцитів цілого локусу фібриногену миші, включаючи всі 3 ланцюги фібриногену, а також кілька кілобаз фланкуючої послідовності. Доданий трансгенний алель фібриногену успадковується менделівським способом, і, як повідомляється, миші демонструють приблизно 2-кратний підвищений рівень фібриногену в плазмі, проте не мають явних ознак захворювання та мають нормальну репродуктивну здатність. 18 Трансгензалежна гіперфібриногенемія не впливала на атерогенез, спричинений дієтою, у мишей C57Bl6 19 або у трансгенних мишей ApoE * 3-Leiden. 20

      Метою поточного дослідження було дослідити, чи викликає хронічно підвищений фібриноген у мишей Hifib (1) посилення внутрішньосудинного відкладення фібрину або змінений обмін фібрину (огену); (2) модифікує утворення тромбоцитів-тромбів у відповідь на гостре пошкодження ендотелію; (3) впливає на частоту або ступінь індукованого стазом тромбозу та ремоделювання судин; або (4) посилює тромбоз у мишей з основним станом гіперкоагуляції. До останньої мети було досягнуто схрещування мишей Hifib із генетично інженерним штамом миші, що несе мутацію (TMPro) у гені тромбомодуліну (TM), 21,22, для отримання мишей Hifib/TMPro. Мутація TMPro різко знижує кофакторну активність ТМ в залежній від тромбіну активації білка С і тим самим викликає стан гіперкоагуляції. Таким чином, аналіз мишей Hifib/TMPro дозволив нам дослідити наслідки гіперфібриногенемії у тварин, які виявили підвищену сприйнятливість до тромбозу.

      Матеріали і методи

      Трансгенні тварини

      Модель гострої травми сонної артерії

      Індуковане FeCl3 пошкодження артерій індукували згідно з опублікованими процедурами. 24,25 Ліву загальну сонну артерію оголили тупим розсіченням, і кровотік реєстрували за допомогою доплерівських зондів (модель 0,5 ВБ; Transonic Systems, Ітака, Нью-Йорк), розташованих навколо дистального кінця артерії. Через десять хвилин після розміщення зонда на адвентиціальну поверхню артерії на 1 хвилину наносили смужку фільтрувального паперу 1,0 × 0,6 мм, змочену 20% FeCl3. Поле промивали сольовим розчином і постійно контролювали потік. У деяких експериментах процедуру потім повторювали на правій загальній каротиді. Час оклюзії виражали як t75, час, коли амплітуда імпульсу падала до 25% від початкового потоку, визначається як середній потік, що виникає між хвилиною 2 і хвилиною 4 після травми. Дані оцінювали на предмет статистичної значущості за допомогою аналізу суми рангу Вількоксона та t-критерію Стьюдента.

      Перев’язка сонної артерії

      Ліву загальну сонну артерію розсікали, а кровотік постійно переривали, застосовуючи тугу лігатуру біля роздвоєння сонної артерії, як описано. 26 Через 4 тижні всіх тварин перфузували при фізіологічному тиску 4% параформальдегідом в 0,1 М фосфатному буфері натрію, рН 7,3. Ліву та праву загальні сонні артерії розтинали, вбудовували в парафін, а серійні зрізи (товщиною 5 мкм) вирізали з інтервалами 150 мкм по всій довжині судини. Оцифровані зображення цих судин аналізували за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень (NIH Image 1.60; National Institutes of Health, Bethesda, MD), як описано. 26

      Визначення рівня фібриногену в плазмі крові, комплексів тромбін-антитромбіну, D-димеру, відкладення фібрину в тканинах та генерації тромбіну in vitro

      Результати

      Метаболізм фібрину (огену) змінений у гіперфібриногенемічних мишей

      Рівні фібриногену у плазмі крові у мишей Hifib віком від 8 до 16 тижнів, визначені методом ІФА, були приблизно в 1,5 рази вищими, ніж у мишей дикого типу (3,5 ± 0,4 проти 2,4 ± 0,4 мг/мл ± SD; Р ≤ .0005; n = 12/група). Значення, отримані методом ІФА, корелювали з кількістю цілого згортається білка в бідній тромбоцитами плазмі. Рівні фібриногену у мишей TMPro- та Hifib/TMPro були такими ж, як і у мишей дикого типу та Hifib, демонструючи, що мутація TMPro не змінює рівні навколишнього фібриногену.

      Рівень плазмового продукту D-димеру з розщепленим фібрином був суттєво підвищений у мишей Hifib (рис. 1) порівняно з мишами дикого типу (40 ± 17 проти 7,9 ± 2 мкг/мл ± SD; P ≤ .0005), а також був вищим, ніж ті, що вимірювались у тварин TMPro (16,6 ± 6 мкг/мл ± SD, P ≤, 005). Відновлення зразків плазми мишей з дефіцитом фібриногену очищеним мишачим фібриногеном у концентраціях до 5 мг/мл не дало виявленого сигналу D-димеру. Подібним чином, збільшення нормальної плазми миші надлишком фібриногену для досягнення плазмової концентрації 5 мг/мл не змінило виміряну концентрацію D-димеру. Ці контрольні експерименти виключають можливість того, що приблизно 5-кратне підвищення D-димеру у мишей Hifib пояснюється перехресною реактивністю досліджуваних антитіл з мишачим фібриногеном. У Hifib/TMPro-мишей рівні D-димеру ще більше зросли (93 ± 40 мкг/мл ± SD). Це показує, що підвищення концентрації фібриногену в плазмі само спричиняло посилене утворення продуктів розпаду фібрину, а за висновком - посилене утворення фібрину. Цей ефект чітко спостерігається у мишей Hifib і є більш вираженим у тварин Hifib/TMPro, демонструючи, що обидві мутації взаємодіють у взаємодії щодо обміну фібрину (огену).

      Плазмова концентрація продукту деградації фібрину D-димеру у мишей-мутантів. Стабільну концентрацію D-димеру в плазмі гіперфібриногенемічних мишей (Hifib та Hifib/TMPro), дикого типу (мас.) Та мишей з дефіцитом тромбомодуліну (TMPro) визначали методом ІФА. Значення наводяться як очевидна концентрація D-димеру, визначена на основі стандарту, побудованого з очищеним людським D-димером. Збільшений рівень D-димеру у гіперфібриногенемічних мишей посилював формування та подальшу деградацію фібрину. Стовпчики вказують середнє значення; зірочками позначається статистична значимість нижче рівня довіри 0,05 (тест t Стьюдента).

      Плазмова концентрація продукту деградації фібрину D-димеру у мишей-мутантів. Стабільну концентрацію D-димеру в плазмі гіперфібриногенемічних мишей (Hifib та Hifib/TMPro), дикого типу (мас.) Та мишей з дефіцитом тромбомодуліну (TMPro) визначали методом ІФА. Значення наводяться як очевидна концентрація D-димеру, визначена на основі стандарту, побудованого з очищеним людським D-димером. Збільшений рівень D-димеру у гіперфібриногенемічних мишей посилював формування та подальшу деградацію фібрину. Стовпчики вказують середнє значення; зірочками позначається статистична значимість нижче рівня довіри 0,05 (тест t Стьюдента).

      Відкладення зшитого фібрину в тканинах гіперфібриногенемічних мишей. Еквівалентні кількості (нормалізовані до початкової маси вологих тканин) нерозчинної у сечовині фракції екстрактів тканин дикого типу (мас.), Дефіцитного тромбомодуліну (TMPro) та гіперфібриногенемічних мишей (Hifib та Hifib/TMPro) піддавали SDS-PAGE (електрофорез натрію додецилсульфат – поліакриламідний гель) та β-ланцюг фібрину (стрілки) було виявлено за допомогою фібрин-специфічних антитіл, що розпізнають неоепітоп, утворений вивільненням фібринопептиду B, опосередкованого тромбіном. Кожна смуга являє собою аналіз одного органу від однієї миші; Показано 6 доріжок на штам миші. Загальний вміст білка, завантажений у кожну смугу, був приблизно еквівалентним, як було встановлено фарбуванням плям Пуансо S (не показано). Надлишок фібрину міститься лише в селезінці мишей Hifib, а не в інших органах, включаючи печінку. Миші з комбінованою гіперфібриногенемією та дефіцитом тромбомодуліну (Hifib/TMPro) виявляють надлишок фібрину в печінці, але не в селезінці та інших органах (серце, легені, нирки, мозок не показано).

      Відкладення зшитого фібрину в тканинах гіперфібриногенемічних мишей. Еквівалентні кількості (нормалізовані до початкової маси вологих тканин) нерозчинної у сечовині фракції екстрактів тканин дикого типу (мас.), Дефіцитного тромбомодуліну (TMPro) та гіперфібриногенемічних мишей (Hifib та Hifib/TMPro) піддавали SDS-PAGE (електрофорез натрію додецилсульфат – поліакриламідний гель) та β-ланцюг фібрину (стрілки) було виявлено за допомогою фібрин-специфічних антитіл, що розпізнають неоепітоп, утворений вивільненням фібринопептиду B, опосередкованого тромбіном. Кожна смуга являє собою аналіз одного органу від однієї миші; Показано 6 доріжок на штам миші. Загальний вміст білка, завантажений у кожну смугу, був приблизно еквівалентним, як було встановлено фарбуванням плям Пуансо S (не показано). Надлишок фібрину міститься лише в селезінці мишей Hifib, а не в інших органах, включаючи печінку. Миші з комбінованою гіперфібриногенемією та дефіцитом тромбомодуліну (Hifib/TMPro) виявляють надлишок фібрину в печінці, але не в селезінці та інших органах (серце, легені, нирки, мозок не показано).

      Гіперфібриногенемія пригнічує генерацію тромбіну

      Концентрація навколишнього плазми сурогатного маркера утворення тромбіну, комплексу тромбін-антитромбін (TAT), була дещо нижчою у Hifib, ніж у звичайних мишей (Hifib: 0,5 ± 1,0 нг/мл; дикого типу: 0,8 ± 1,0 нг/мл; 3А), але ця різниця статистично не була суттєвою. Підтверджуючи попередні висновки, 21 миша TMPro демонструвала вищі рівні TAT, ніж миші дикого типу (2,6 ± 2,1 нг/мл; P ≤ 0,05). Рівні TAT у мишей Hifib/TMPro (0,4 ± 0,9 нг/мл) нагадували ті, що спостерігались у мишей Hifib, і були значно нижчими, ніж у мишей TMPro (P ≤ 0,05). Ін’єкція 0,05 од мишачого α-тромбіну мишам дикого типу та TMPro збільшувала рівень TAT у плазмі до 30 ± 7 нг/мл та 56 ± 18 нг/мл відповідно, що узгоджується із збільшенням залежності від тромбіну ампліфікації коагуляції у мишей TMPro. Ті самі маніпуляції не викликали посиленого утворення комплексу TAT у мишей Hifib/TMPro (27 ± 9 нг/мл), порівняно з мишами дикого типу (Рисунок 3B).

      Плазмова концентрація тромбін-антитромбінового комплексу у мишей-мутантів. Рівні комплексів тромбін-антитромбіну (ТАТ) у плазмі крові вимірювали методом ІФА. (A) Рівні TAT у стаціонарному стані у гіперфібриногенемічних мишей (Hifib) та у гіперфібриногенемічних мишей із накладеним дефіцитом тромбомодуліну (HiFib/TMPro) порівнянні з показниками, виміряними у мишей дикого типу (мас.). (B) Мишам вводили внутрішньовенно болюсно 0,05 U мишачого α-тромбіну, щоб індукувати утворення комплексу TAT, і рівні TAT вимірювали через 10 хвилин після інфузії тромбіну. Гіперфібриногенемія пригнічує збільшення утворення ТАТ, яке спостерігається у мишей з ізольованим дефіцитом тромбомодуліну (TMPro). Значення наводяться як очевидна концентрація TAT, визначена на основі стандарту, побудованого з очищеним TAT людини.

      Плазмова концентрація тромбін-антитромбінового комплексу у мишей-мутантів. Рівні комплексів тромбін-антитромбіну (ТАТ) у плазмі крові вимірювали методом ІФА. (A) Рівні TAT у стаціонарному стані у гіперфібриногенемічних мишей (Hifib) та у гіперфібриногенемічних мишей із накладеним дефіцитом тромбомодуліну (HiFib/TMPro) порівнянні з показниками, виміряними у мишей дикого типу (мас.). (B) Мишам вводили внутрішньовенно болюсно 0,05 U мишачого α-тромбіну, щоб індукувати утворення комплексу TAT, і рівні TAT вимірювали через 10 хвилин після інфузії тромбіну. Гіперфібриногенемія пригнічує збільшення утворення ТАТ, яке спостерігається у мишей з ізольованим дефіцитом тромбомодуліну (TMPro). Значення наводяться як очевидна концентрація TAT, визначена на основі стандарту, побудованого з очищеним TAT людини.

      Для подальшої оцінки впливу рівня фібриногену на утворення тромбіну ми вимірювали вироблення тромбіну in vitro у бідній тромбоцитами афібриногенемічній плазмі миші (приготовленій з мишами з дефіцитом фібриногену), яка поповнювалася різною кількістю очищеного фібриногену миші (рис. Піковий рівень активності тромбіну, а також сумарна площа кривої генерації тромбіну була обернено корельована з плазмовою концентрацією фібриногену. Це спостереження свідчить про те, що підвищений рівень фібриногену зменшує утворення тромбіну у мишей, відтворюючи попередні висновки, отримані за допомогою плазми, заповненої фібриногеном, від пацієнтів з афібриногенемічними людьми. 28

      Вплив фібриногену на утворення in vitro тромбіну. Вироблення тромбіну in vitro як функцію концентрації фібриногену в плазмі визначали шляхом вимірювання амідолітичної активності тромбіну, що генерується з часом у плазмі мишей з дефіцитом фібриногену, відновлених з різною кількістю фібриногену миші. Вироблення тромбіну корелює обернено з концентрацією фібриногену в плазмі.

      Вплив фібриногену на утворення in vitro тромбіну. Вироблення тромбіну in vitro як функцію концентрації фібриногену в плазмі визначали шляхом вимірювання амідолітичної активності тромбіну, що генерується з часом у плазмі мишей з дефіцитом фібриногену, відновлених з різною кількістю фібриногену миші. Вироблення тромбіну корелює обернено з концентрацією фібриногену в плазмі.

      Гіперфібриногенемія не прискорює формування артеріальних тромбоцитарних тромбів

      Гіперфібриногенемія не викликає утворення тромбу у відповідь на судинний застій

      Ці дані показують, що існуюча гіперфібриногенемія не викликає тромбозів, що перевищують показники, виявлені у тварин дикого типу, або не змінює частоти утворення неоінтіми в цій моделі. З іншого боку, гіперфібриногенемія модифікує ремоделювання судин, спричинене припиненням кровотоку, що призводить до посилення гіперплазії інтими та звуження просвіту судини.

      Обговорення

      Наші висновки дають докази того, що підвищений рівень фібриногену викликає посилене відкладення фібрину в конкретних органах та посилює неоінтимальну гіперплазію в експериментальній моделі ремоделювання судин, спричиненого стазом. З іншого боку, гіперфібриногенемія не впливала на ступінь або частоту артеріальних тромбозів, спричинених ні гострим хімічним пошкодженням, ні стазом кровотоку. Дійсно, підвищений рівень фібриногену у плазмі крові у мишей пригнічував утворення тромбіну у плазмі in vitro, а також у крові тварин, які зазнали тромботичного впливу. Ці дані встановлюють прямий причинно-наслідковий зв’язок між помірним підвищенням концентрації фібриногену та змінами функції гемостатичної системи та відповіддю на травму судин відповідно.

      Таким чином, підвищений фібриноген у плазмі крові, здається, пригнічує утворення тромбіну в плазмі, а також посилює відкладення фібрину в деяких органах. Одне з пояснень цього потенційного парадоксу, що узгоджується з нашими експериментальними висновками, полягає в тому, що тромбін, утворившись, може секвеструватися на фібрині (огені), а потім або швидко виводиться з кровообігу 40,41, або асоціюється з фібрином, що відкладається на судинній стінці . Фібрин-асоційований тромбін захищений від інактивації антитромбіном і зберігає активність, 42,43 і тим самим може призвести до локалізованого розповсюдження та посилення відкладення фібрину, одночасно пригнічуючи утворення тромбін-антитромбінового комплексу.

      Таким чином, наші дані дають прямі експериментальні докази того, що помірне підвищення концентрації фібриногену призводить до посиленого утворення фібрину та подальшої деградації фібрину, зміненої функції системи згортання крові та зміненої реакції на судинну травму. Ці висновки встановлюють, що гіперфібриногенемія - це більше, ніж побічний продукт серцево-судинних захворювань, але може - позитивно чи негативно - визначати ступінь тяжкості та/або прогресування судинних захворювань. Зауважимо, що наші висновки передбачають, що видоспецифічні властивості фібриногену, такі як високоафінна взаємодія тромбіну з γ'-ланцюгом фібриногену, можуть надавати фізіологічно значущі ефекти на людину, що може уникнути виявлення на мишачих моделях, використовуваних для зондування функції фібриногену.

      Попередньо опубліковано в Інтернеті як Paper First Edition Paper, 13 листопада 2003 р .; DOI 10.1182/кров-2003-08-2886.