Повторне почуття голоду призводить до розвитку вісцерального ожиріння та метаболічного синдрому у мишачої моделі

Центр досліджень печінки та імунології, Інститут традиційної медицини та біологічних наук Університету Теджон, 22-5, Daeheung-dong, Jung-gu, Daejeon, Республіка Корея

Чон-Мін Хань,
Хен-Гег Кім,
Джин-Сок Лі,
Мін-Кюн Чой,
Янг-Ае Кім,
Син Чангуе

Цифри

Анотація

Цитування: Han J-M, Kim H-G, Lee J-S, Choi M-K, Kim Y-A, Son C-G (2014) Повторне почуття голоду призводить до розвитку вісцерального ожиріння та метаболічного синдрому в моделі миші. PLoS ONE 9 (5): e98276. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0098276

Редактор: Джулі А. Човен, Госпітальний інфантильний університет Ніньо Хесуса, CIBEROBN, Іспанія

Отримано: 12 лютого 2014 р .; Прийнято: 30 квітня 2014 р .; Опубліковано: 30 травня 2014 р

Фінансування: Це дослідження було підтримано Програмою фундаментальних наукових досліджень через Національний науково-дослідний фонд Кореї (NRF), заснований Міністерством освіти, науки та технологій (2012R1A1A2001519), Проектом досліджень та розвитку східної медицини, Міністерством охорони здоров'я та соціального забезпечення (B120047) та «Дослідження контролю старіння за допомогою енергетичного обміну на основі східної медицини» Корейського інституту східної медицини, Республіка Корея (K12101). Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Розлади, пов’язані з ожирінням, стали глобальними проблемами зі здоров’ям, і за оцінками, щороку смертність становила 2,8 мільйона, зі значним збільшенням захворюваності [1]. Серед цих порушень метаболічний синдром є загальним і включає такі захворювання, як вісцеральне ожиріння, дисліпідемія, резистентність до інсуліну та стеатоз печінки, що може призвести до цукрового діабету, серцево-судинних захворювань та інсульту [2]. Отже, зростає потреба у дослідженнях, що стосуються контролю над ожирінням та профілактики метаболічного синдрому.

Ожиріння виникає через дисбаланс споживання і витрати калорій в організмі. Для багатьох людей цей дисбаланс виникає внаслідок надмірної їжі та відсутності фізичних вправ. Людський організм відрізняється високою гнучкістю щодо споживання їжі та виведення енергії в широкому діапазоні калорій. Зокрема, здатність накопичувати зайві калорії у вигляді жиру в різних частинах тіла розвинулася під час голодування або нестачі споживання їжі протягом тривалого періоду часу [3]. Мозок регулює енергетичний гомеостаз у відповідь на сигнали як жирової тканини, так і шлунково-кишкового тракту шляхом регулювання споживання їжі та витрат енергії, що призводить до підтримання стабільної маси тіла [4]. Відомо, що кілька гормонів голоду, такі як лептин, резистин та грелін, опосередковують ці процеси [5].

Часто люди в сучасному суспільстві намагаються зменшити масу тіла за допомогою дієти з контролем калорій та періодичного голодування протягом короткого періоду [6], [7]. Багато клінічних досліджень продемонстрували, що неконтрольовані харчові звички, такі як зменшення частоти прийому їжі, повторне голодування та періодичне переїдання, були пов'язані з розладами, пов'язаними з ожирінням [8] - [11]. Наприклад, протягом місяця Рамадан практикуючі мусульмани утримуються від прийому їжі, пиття та куріння від світанку до заходу сонця з подальшим компенсаційним переїданням; багато спостерігачів Рамадану відчувають збільшення ваги та високий рівень ліпідів у плазмі [12], [13]. Ця закономірність може бути схожою на звички людей у сучасному суспільстві, які не дотримуються звичайного графіку харчування. Тому ми припустили, що повторне почуття голоду сприяло розвитку вісцерального ожиріння та метаболічного синдрому.

У цьому документі ми оцінили повторне почуття голоду як фактор високого ризику для розвитку метаболічного синдрому та його основоположних механізмів на тваринній моделі.

Матеріали і методи

Тварини та експеримент

Специфічних безпатогенних 3-тижневих (3 Вт; n = 20) та 6-тижневих (6 Вт; n = 20) мишей ICR були придбані у заводчика комерційних тварин Daehan Biolink (Gyeongido, Корея). Мишей розміщували в екологічно контрольованому приміщенні при 22 ± 2 ° C, 55% ± 10% відносної вологості та 12-годинному циклі світло/темрява. Мишей годували комерційними гранулами (Koatech, Gyeongido, Корея) та водою з-під крану протягом 1 тижня. Всього 40 мишей було випадковим чином розділено на дві групи, що складалися з 10 мишей у кожній групі: (1) групи споживання їжі ad libitum (AL) у віці 3W та 6W (3W-AL та 6W-AL), та (2) групи обмеження їжі (FR) (альтернативний денний прийом їжі лише з 1/3 середньостатистичної групи їжі) у віці 3W та 6W (3W-FR та 6W-FR) відповідно. Експеримент з обмеженням їжі тривав 8 тижнів. Цей експеримент на тваринах був схвалений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Університету Теджон (DJUARB2012-010) і проводився відповідно до Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин, опублікованого Національним інститутом охорони здоров’я США (Бетесда, Меріленд).

Вимірювання споживання їжі, маси тіла та маси органу

Споживання їжі контролювали щодня, а масу тіла вимірювали двічі на тиждень. В останній день всіх мишей знеболювали ефіром через 12 годин голодування і збирали цілу кров через черевну аорту. Печінку, м’язи та жирові прокладки (вісцеральна жирова тканина, ПДВ; заочеревинна жирова тканина, RAT; та епідидимальна жирова тканина, EAT) видаляли, зважували та заморожували в рідкому азоті або зберігали в RNAlaterTM (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія, США). Мозок швидко видаляли, а гіпоталамус розтинали для аналізу експресії генів (n = 5) або вестерн-блот-аналізу (n = 5). Гістологічні дослідження зразків фіксували у 10% розчині формаліну протягом 24 годин.

Аналіз біомаркерів сироватки

Всі концентрації параметрів вимірювали за допомогою сироваток, отриманих з крові натще, яка попередньо згорталася (15 хв, кімнатна температура) та центрифугувалася (15 хв, 1000 × g). Потім зразки сироватки негайно заморожували при -80 ° C до подальшого аналізу. Рівні аспартатамінотрансферази (AST), аланінамінотрансферази (ALT), лужної фосфатази (ALP), загального холестерину, ліпопротеїдів високої щільності (HDL), тригліцеридів та глюкози визначали за допомогою автоаналізатора (Chiron, Emeryville, CA, USA) у сироватці крові.

Визначення адипокінів та цитокінів у сироватці крові

Рівні лептину в сироватці крові, фактора некрозу пухлини-α (TNF-α) та інтерлейкіну-6 (IL-6) вимірювали за допомогою комерційно доступних наборів імуноферментних аналізів (ІФА) відповідно до інструкцій виробника (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США ). Концентрації греліну в сироватці крові вимірювали за допомогою комерційного набору ELISA (RayBiotech Inc., Norcross, GA, USA), а рівні адипонектину та резистину в сироватці крові вимірювали за допомогою комерційного набору ELISA (AdipoGen, Inc., Сеул, Корея). Були сформовані стандартні криві, з яких розраховували концентрації білка.

Визначення рівня ліпідів у тканинах печінки

Печінку гомогенізували в PBS і визначали концентрацію білка. Гомогенат печінки (300 мкл) екстрагували 5 мл хлороформу/метанолу (2∶1) та 0,5 мл 0,1% сірчаної кислоти [14]. Аликвоту органічної фази збирали, сушили під азотом і ресуспендували в 2% Triton X-100. Вміст печінкових тригліцеридів та холестерину визначали за допомогою комерційно доступних наборів (Asan Pharm. Co., Сеул, Корея).

Гістопатологічний аналіз жирної печінки та ожиріння

Аналіз qRT-ПЛР

Вестерн-блот-аналіз

Гіпоталамус тканин мозку гомогенізували в крижаному буфері RIPA, доповненому протеазами (Calbiochem, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) та інгібіторами фосфатази (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Концентрації білка визначали за допомогою білкового аналізу біцинхонінової кислоти (BCA) (Sigma-Aldrich). Рівні кількості білкових екстрактів (50 мкг) фракціонували за допомогою SDS-PAGE і переносили в 0,45 мкм мембрани нітроцелюлози. Блокування мембран проводили інкубацією протягом 1 години при кімнатній температурі з 5% знежиреного сухого молока в солі, забуференному Трис, що містить 0,1% Твін-20. Потім мембрани інкубували протягом ночі при 4 ° С з РОМС та первинним антитілом до актину (Санта Круз Біотехнологія, Санта Круз, Каліфорнія, США) у розведенні 1-1000. Плямки промивали три рази промивним буфером (20 мМ Трис, 160 мМ NaCl і 0,1% Твін 20), після чого проводили 1-годинну інкубацію з відповідним кон’югованим пероксидазою хрону вторинним антитілом. Активність пероксидази виявляли за допомогою реагенту для виявлення ІМмоболон Вестерн HRP (Millipore, Billerica, MA, США) за допомогою зчитувача зображень (Thermo Fisher Scientific, Пітсбург, Пенсільванія, США).

Статистичний аналіз

Статистичну значущість аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) з подальшим тестом Даннета за допомогою спеціального програмного забезпечення JMP 5.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Результати виражаються як середнє значення ± стандартне відхилення (SD). У всіх аналізах * p Рисунок 1. Споживання їжі та маса тіла.

(А) Споживання їжі контролювали щодня. (В) Масу тіла вимірювали двічі на тиждень. Кожна точка представляє середнє значення ± стандартне відхилення (SD; n = 10). * p Рисунок 2. Вага жирової тканини та гістологічні дані про жирові тканини.

(A) Жирові прокладки зважували з вісцеральної жирової тканини (VAT), заочеревинної жирової тканини (RAT) та епідидимальної жирової тканини (EAT). Дані виражаються як середні значення ± SD (n = 10). * p Таблиця 2. Споживання їжі, маса тіла та печінки та біохімічні параметри сироватки.

Рівні сироватки метаболічних та запальних медіаторів

Рівні резистину в сироватці крові були значно вищими в групах FR порівняно з групами AL (р 0,05), тоді як рівні лептину були значно підвищені в групах FR порівняно з групами AL (p Рисунок 3. Рівні білків сироватки метаболічних та прозапальних медіаторів.

(A) Рівні білка резистину, адипонектину та лептину, а також (B) греліну, фактора некрозу пухлини-α (TNF-α) та інтерлейкіну-6 (IL-6) у сироватці крові аналізували методом ІФА. Дані виражаються як середні значення ± SD (n = 10). * p Рисунок 4. Рівні експресії генів у вісцеральній жировій тканині (ПДВ).

(A) Визначали рівні експресії мРНК жирної кислоти синтази (FAS), регулюючого елемент стеролу білка-1c (SREBP-1c) та інтерлейкіну-6 (IL-6), а також (B) резистину, адипонектину та лептину за допомогою аналізу qRT-PCR. Дані виражаються як середні значення ± SD (n = 10, кратна зміна щодо групи AL). * p Рисунок 5. Рівні експресії генів у скелетних м’язах.

Рівні мРНК транспортера глюкози 4 (GLUT4), АМР-активованої протеїнкінази (AMPK) та активованого проліфератором рецептора альфа (PPARα) визначали за допомогою аналізу qRT-PCR. Дані виражаються як середні значення ± SD (n = 10, кратна зміна щодо групи AL). * p Рисунок 6. Вимірювання стеатозу печінки.

(А) Печінкові тригліцериди та холестерин вимірювали за допомогою комерційно доступних наборів. Дані виражаються як середні значення ± SD (n = 10 відповідно). * p Рисунок 7. Рівні експресії генів у печінці.

Рівні мРНК зв’язуючого білка-1c регулятора стеролу (SREBP-1c), синтази жирних кислот (FAS), гамма-рецептора, що активується проліфератором (PPARγ), дезатурази-стеароїл-CoA (SCD-1), рецептора, що активується проліфератором альфа (PPARα) та AMP-активовану протеїнкіназу (AMPK) визначали за допомогою qRT-PCR. Дані виражаються як середні значення ± SD (n = 10, кратна зміна щодо групи AL). * p Рисунок 8. Рівні експресії білка та генів у мозку.

(A) Активність проопіомеланокортину (POMC) аналізували за допомогою Вестерн-блоттінгу (n = 5). (B) Рівні мРНК POMC та нейропептиду Y (NPY), а також (C.) рецептор меланокортину-4 (MC4R) та білок, пов'язаний з геном агуті (AgRP), визначали за допомогою qRT-PCR. Дані виражаються як середні значення ± SD (n = 5, кратна зміна щодо групи AL). * p Рисунок 9. Графічне резюме метаболічного синдрому шляхом повторного почуття голоду.

Ці висновки базуються на тваринній моделі, яка має неминучі обмеження; однак наші дані були отримані з дубльованих експериментів (з використанням мишей віком 3 та 6 тижнів), а також з іншої моделі мишей BALB/c. Нещодавно були розглянуті модифіковані схеми дієти для зменшення калорій, включаючи пропуск звичайного прийому їжі, чергування дня голодування або періодичне голодування. Вони ефективні для зменшення маси тіла та збільшення тривалості життя [51], [52]. Однак неконтрольовані харчові звички з альтернативним компенсаторним переїданням протягом дня можуть викликати порушення, подібні до метаболічного синдрому. Відповідно, ми можемо зробити висновок, що повторне почуття голоду на тваринній моделі викликало типові характеристики метаболічного синдрому; чітке вісцеральне ожиріння, гіперліпідемія, гіперглікемія та стеатоз печінки, а основні механізми, що лежать в основі, включають дисбаланс адипокінів, особливо лептину. Отримані нами результати є першими експериментальними доказами, які чітко демонструють важливість дотримання регулярного щоденного графіка прийому їжі для профілактики метаболічного синдрому.

Подяка

Англійська мова в цьому документі перевірена принаймні двома професійними редакторами, обидва носіями англійської мови. Сертифікат див. На веб-сайті: http://www.textcheck.com/certificate/6lpLoE.

Внески автора

Задумав та спроектував експерименти: JMH HGK CGS. Виконував експерименти: JMH HGK JSL MKC CGS. Проаналізовано дані: JMH HGK JSL MKC YAK CGS. Внесені реагенти/матеріали/інструменти аналізу: MKC YAK. Написав папір: JMH CGS.