Поліфеноли кави надають гіпохолестеринемічну дію на даніо, яка харчується дієтою з високим вмістом холестерину

Анотація

Передумови

Гіперхолестеринемія є важливим фактором ризику розвитку ішемічної хвороби серця. Деякі дієтичні поліфеноли, такі як поліфеноли кави (CPP), знижують рівень холестерину. Механізм цього ефекту зниження рівня холестерину до кінця не вивчений, хоча, як повідомляється, 5-CQA, головний компонент CPP, інгібує біосинтез холестерину. Тут ми досліджували механізм зниження холестерину ефекту СРР на основі експресії генів, пов’язаної з метаболізмом холестерину в печінці. Ми також досліджували вплив CPP на накопичення ліпідів у судинах у даніо з підвищеною холестериновою дієтою, спричиненою гіперхолестеринемією.

Методи

Протягом 14 тижнів дорослих даніо отримували контрольну дієту, дієту з високим вмістом холестерину або останню дієту, доповнену CPP. Щоб виміряти ступінь накопичення ліпідів у судинах, протягом 10 днів личинок даніо (які є оптично прозорими) годували цими ж дієтами з додаванням флуоресцентного ефіру холестерилу.

Результати

У дорослих даніо, додавання CPP до дієти з високим вмістом холестерину суттєво пригнічувало збільшення рівня холестерину в плазмі та печінці, яке спостерігалося при вживанні рибою тієї ж дієти, у якій бракувало CPP. Рівні транскрипції генів печінки hmgcra (кодує 3-гідрокси-3-метилглутарил-кофермент А-редуктазу А, фермент, що обмежує швидкість, у біосинтезі холестерину) та mtp (що кодує мікросомальний білок, що переносить тригліцериди, білок, що переносить ліпіди, необхідний для збирання та секреції ліпопротеїдів), були значно нижчими у риб, що годувались CPP-вмісною дієтою, ніж у риб, які харчувались без дієти з високим вмістом холестерину. На відміну від рівня експресії гена печінки cyp7a1a (кодуючи поліпептид 1a цитохрому P450 підродини A сімейства 7, фермент, що обмежує швидкість, для біосинтезу жовчних кислот) суттєво збільшився після споживання дієти, що містить CPP. У личинових риб накопичення флуоресцентно міченого холестерину в каудальній артерії значно зменшилося на дієті, що містить CPP.

Висновки

Прийом CPP пригнічував накопичення холестерину в плазмі, печінці та судинній системі даніо. Зниження регуляції синтезу холестерину та ліпопротеїнів та регуляція синтезу жовчних кислот у печінці можуть бути основними основними механізмами, за допомогою яких CPP здійснюють свої гіпохолестеринемічні ефекти. Прийом СРР може допомогти запобігти гіперхолестеринемії у людей та керувати нею, і подальші дослідження за цим напрямком із використанням різних рівнів дози СРП є необхідними.

Передумови

Серцево-судинні захворювання є основною причиною захворюваності та смертності у всьому світі. Гіперхолестеринемія викликає атеросклероз і є основним фактором ризику розвитку серцево-судинних захворювань. Кілька епідеміологічних досліджень чітко показали, що підвищений рівень холестерину в плазмі крові - особливо холестерину ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ) - пов'язаний з розвитком серцево-судинних захворювань [1, 2]. Важливо, що гіперхолестеринемія є фактором ризику, що піддається зміні. Зміни способу життя та вживання в їжу різних харчових сполук - таких як зелений чай, рослинні стерини та соєві білки - можуть зменшити гіперхолестеринемію [3].

У всьому світі кава є одним із найпоширеніших напоїв і є надзвичайно багатим джерелом біологічно активних поліфенолів [4]. Препарати кавового поліфенолу (CPP) багаті на кофеїлхінові кислоти (CQA), ферулоїлхінові кислоти (FQA) та дикафеоїлхінінові кислоти (diCQA). Фізіологічна діяльність CPPs включає дозозалежне зниження артеріального тиску, поліпшення функції ендотелію та придушення накопичення жиру в організмі, спричиненого дієтою, та гіперглікемії після їжі [5–10]. Нещодавно повідомлялося про зниження рівня холестерину на CPPs та 5-CQA (хлорогенова кислота) [9, 11–14]. Однак про механізм дії цих речовин повідомляється небагато: повідомляється лише про те, що 5-CQA пригнічує біосинтез холестерину [11, 14]. Жоден з можливих ефектів CPP на накопичення ліпідів у судинах - важливий ранній етап атерогенезу - не вивчався.

Даніо (Даніо реріо) органи і тканини як за будовою, так і за функцією подібні до людських. Отже, даніо все частіше використовується як модель захворювання людей, оскільки (а) риба легко піддається генетичним маніпуляціям; (b) він легко розмножується в неволі; та (c) експериментальні колонії можуть недорого утримуватися [15]. Крім того, кілька досліджень виявили, що даніо є чудовою моделлю ліпідного обміну хребетних [16, 17]. Столєтов та ін. [18] показали, що даніо, що годували дієту з високим вмістом холестерину, розвинув гіперхолестеринемію, виявив надзвичайну здатність окислювати ліпопротеїни та накопичені судинні ліпіди. Вони дійшли висновку, що даніо є підходящою моделлю для вивчення патологічних подій, важливих на ранніх стадіях атерогенезу.

Тут ми досліджували наслідки прийому CPP всередину даніо, наданих гіперхолестеринемічним споживанням дієти з високим вмістом холестерину. Ми вимірювали рівні холестерину в плазмі та печінці, рівні експресії генів печінки, що беруть участь у метаболізмі холестерину, і ступінь накопичення ліпідів у судинах. Ми порівняли дані тестових і контрольних рибних когорт.

Методи

Підготовка CPP

CPP готували екстракцією гарячою водою із смажених кавових зерен, а склад CPP визначали за допомогою ВЕРХ-аналізу екстракту [9]. Загальний вміст поліфенолу в препараті CPP становив 77,1% (мас./Мас.). Окремі поліфенольні композиції складали (всі мас.): 7,7% 3-CQA; 15,5% 4-CQA; 31,9% 5-CQA; 7,6% 3- FQA; 5,6% 4-FQA; 8,5% 5-FQA; 9,0% 3,4-diCQA; 8,9% 3,5-diCQA; і 5,3% 4,5-діККА. Порошок CPP не містив кофеїну.

Тварини

Дорослих даніо придбали у місцевого постачальника домашніх тварин (Meito Suien Co., Ltd., Remix, Нагоя, Японія). Всю рибу вирощували та підтримували при циклі 14: 10 год світло: темно при 28 ° C, а якість води підтримували, як описано в Книга риб-даніо[19]. З усією рибою поводились суворо відповідно до Керівних принципів Комітету з догляду за тваринами корпорації Kao, Книга риб-даніо, та Посібник з догляду та використання лабораторних тварин (8-е видання) [20].

Дієти

Контрольна дієта містила 75% (мас./Мас.) Стандартної чау-риби-даніо (Otohime B2; Marubeni Nisshin Feed Co. Ltd., Токіо, Японія) і 25% (мас./Мас.) Глютену (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Японія). Дієта з високим вмістом холестерину була контрольною дієтою з додаванням 4% (мас./Мас.) Холестерину (Wako Pure Chemical Industries). “Дієта CPP” була контрольною дієтою з додаванням як 4% (мас. /%) Холестерину, так і 5% (мас./Мас.) CPP. Для вимірювання вмісту холестерину в чау Otohime B2 ліпіди екстрагували за допомогою звичайного методу Фольча [21]. Вміст холестерину в контрольній дієті до додавання холестерину становив 0,4% (мас./Мас.).

Експериментальний дизайн

Експеримент 1: Самку дорослих даніо-риб через 6 місяців після запліднення зважували під наркозом 0,005% (мас./Об.) Трикаїну (Sigma-Aldrich, MO, США) і розподіляли по трьом групам з 7 або 8 риб з подібною масою тіла. Кожну групу помістили в резервуар об'ємом 1,7 л. Трьом групам годували контроль, високий рівень холестерину або дієту CPP двічі на день (20 мг їжі/день на рибу) протягом 14 тижнів. Під час годування приплив води до резервуарів зупинявся на 45 хв, а рибам дозволялося споживати свій раціон на 30 хв. В останній день експерименту всіх риб було евтаназовано, виміряно вагу тіла, взяті проби крові з кожної хвостової артерії (в гепаринізовані скляні капіляри) та розсічені печінки. Зразки з кожної печінки зберігали у двох примірниках для аналізу рівнів ліпідів та моделей експресії мРНК.

Аналіз рівня ліпідів у плазмі та печінці

Плазму отримували центрифугуванням зразків крові при 1500g протягом 5 хв при 4 ° C. Ліпіди печінки екстрагували за допомогою звичайного методу Фолха [21]. Рівні холестерину в плазмі та печінці визначали ферментативно за допомогою наборів для тесту на холестерин (Wako Pure Chemical Industries, Ltd).

Вилучення РНК та кількісна ПЛР у режимі реального часу

Загальну РНК виділяли із зразків печінки риб в експерименті 1 за допомогою міні-наборів RNeasy Lipid Tissue Mini (Qiagen KK, Токіо, Японія) і транскрибували в кДНК за допомогою РНК високої ємності до кДНК (Applied Biosystems, CA, США). Кількісна ПЛР в реальному часі проводилася на платформі ABI PRISM (Applied Biosystems); аналіз зразків кДНК використовував TaqMan Fast Universal PCR Master Mix. Аналізи TaqMan досліджували рівні експресії таких генів: eef1a1l1 (фактор подовження еукаріотичного перекладу 1 альфа 1, як 1; Dr03432748_m1); hmgcra (3-гідрокси-3-метилглутарил-кофермент А редуктаза А; Dr03428716_m1); mtp (мікросомний білок, що переносить тригліцериди; Dr03133293_m1); і cyp7a1a (поліпептид 1a підродини A сімейства 7 цитохрому P450; Dr03177268_s1). Кожен базовий та пороговий рівень були встановлені вручну відповідно до інструкцій виробника. Відносні рівні експресії мРНК визначали, використовуючи рівень експресії eef1a1l1 як внутрішній стандарт.

Статистичний аналіз

Усі дані відображаються як середні значення ± SE (стандартна помилка). Значимість спостережуваних різниць оцінювали за допомогою дисперсійного аналізу з подальшим застосуванням множинного порівняння різниці часткових найменших квадратів Фішера. Різниця вважалася суттєвою, якщо порівняти P-значення було

Результати

Споживання їжі та маса тіла дорослих даніо

Споживання їжі в експерименті 1 оцінювали щоденним спостереженням. Протягом експериментального періоду вся риба повністю з'їдала кожну дієту (20 мг їжі на день на рибу). Вага тіла значно зросла (P Фігура 1

Рівень холестерину в плазмі та печінці у дорослих даніо

Ми вивчили рівень холестерину в плазмі та печінці наприкінці експерименту 1. Рівень холестерину в плазмі був значно вищим (P Малюнок 2

Експресія мРНК у печінці дорослих даніо

Намагаючись визначити механізм, за допомогою якого CPP здійснювали свої антигіперхолестеринемічні ефекти, ми вимірювали рівні експресії мРНК генів, пов'язаних з метаболізмом холестерину в печінці. Рівні мРНК, транскрибовані з hmgcra і mtp були значно нижчими (P Малюнок 3

Судинне накопичення холестерину у личинкових даніо

Ми дослідили вплив харчових добавок CPP на ступінь накопичення судинного холестерину в каудальних артеріях оптично прозорих личинок даніо. Показані оптичні та флуоресцентні зображення (рис. 4А та В, відповідно). Холестерин, позначений флуоресцентним маркером, накопиченим у хвостовій артерії (стрілки на малюнку 4B). На фігурі 4C показано зображення флуоресценції від тулуба до хвоста (включаючи хвостову артерію) риб з кожної дієтичної групи. Рівень флуоресценції каудальної артерії холестерину, позначений флуоресцентним маркером, був значно вищим (P Малюнок 4

Обговорення

Ми дослідили, чи вживання дієти з високим вмістом холестерину в організмі CPP може пом'якшити гіпохолестеринемічний ефект колишньої дієти у даніо. Додавання CPP до дієти з високим вмістом холестерину пригнічувало підвищення рівня холестерину в плазмі крові, спричинене недоповненою дієтою. Чо та співавт. [11] та Wan et al. [12] повідомляв, що додавання 5-CQA, головного компонента CPP, до дієт з високим вмістом жиру або високим вмістом холестерину пригнічує збільшення рівня холестерину в плазмі крові, яке зазвичай спостерігається, коли такі не доповнені дієти годували гризунами. У нашому дослідженні 5-CQA становив 31,9% (мас./Мас.) Доданих CPP; Таким чином, 5-CQA був основним присутнім поліфенолом. Наші результати свідчать про те, що дієтичні CPP знижують рівень холестерину в плазмі крові, частково тому, що CPP мають високий рівень 5-CQA. Крім того, ми виявили, що добавки CPP пригнічують підвищення рівня печінкового холестерину, спричинене прийомом дієти з високим вмістом холестерину. Муразе та ін. [9] також виявив, що CPP пригнічують накопичення печінкового холестерину у мишей, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру. Дані вказують на те, що CPP мають гіпохолестеринемічний ефект, впливаючи на метаболізм холестерину в печінці. CPP, що потрапляють у їжу або напої (кава), можуть бути корисними для профілактики та лікування гіперхолестеринемії.

Чо та співавт. [11], згаданий вище, показав, що гіпохолестеринемічні ефекти 5-CQA можна пояснити зниженням ферментативної активності HMGCR у печінці гризунів. Таке зниження регуляції активності, пов'язане з падінням рівня транскрипції мРНК з Hmgcr, було запропоновано бути основним механізмом, завдяки якому дієтичні поліфеноли епігалокатехін-3-галлат, ресвератрол, куркумін та гесперетин мають гіпохолестеринемічну дію [28–33]. Хоча взаємозв'язок структури та активності цих поліфенолів залишається недостатньо зрозумілим, накопичені дані спонукають нас припустити, що поліфенольні сполуки регулюють печінкову Hmgcr експресія і, отже, рівні HMGCR. Якщо так, то регулювання печінкової норми hmgcra вираз при дієтичній добавці CPP може бути пов'язаний не тільки з дією 5-CQA, але і з діяльністю інших CPP.

Збільшення куудальної артерії в накопиченні флуоресцентної форми холестерину у риб, що харчуються дієтою з високим вмістом холестерину, пригнічувалось одночасним прийомом СРР. Fang та ін. [34] встановили, що коли личинок даніо годували лише дієтою з високим вмістом холестерину лише протягом 2 тижнів, рівень певних окислених ефірів холестерилу, ідентичних таким, що присутні в мінімально окисленому ЛПНЩ у людей та мишачих атеросклеротичних ураженнях, зростав до 70 разів. У ссавців гіперхолестеринемія підвищує рівні окислених ЛПНЩ та пероксидів ліпідів у плазмі, що, у свою чергу, сприяє адгезії моноцитів та лімфоцитів до ендотелію судин [35, 36]. Примітно, що хлорогенова кислота може інгібувати індуковане міддю окислення ЛПНЩ людини in vitro [37]. Чанг та ін. [38] встановив, що хлорогенова кислота пригнічує індуковану IL-1β експресію молекул адгезії та індукує продукцію активних форм кисню. Отже, спостережуване придушення накопичення флуоресцентного холестерину в каудальній артерії при дієтичному вживанні СРР може бути пов’язано з пригніченням окисненням холестерину або ліпопротеїнів (або тим і іншим) компонентами CPP та зменшенням експресії адгезійних молекул судинного ендотелію.

Тут ми показали, що CPP мають гіпохолестеринемічну дію та пригнічують накопичення холестерину в судинах. Однак наслідки прийому кави на гіперхолестеринемію та серцево-судинні захворювання залишаються суперечливими [39, 40]. Хоча кава багата CPP, кава містить ще кілька потенційно біоактивних сполук, включаючи кофеїн, вітамін B3, магній, калій, волокнисті матеріали та гідроксигідрохінон [40, 41]. Ця остання сполука, яка є генератором активних форм кисню, компрометує покращення артеріального тиску та функції ендотелію, спричинене хлорогеновою кислотою [42]. Подальші дослідження необхідні для визначення сполук кави, що надають сприятливий чи згубний вплив на метаболізм холестерину та судинну ендотеліальну систему.

Висновки

Тут ми показали, що проковтування CPP гіперхолестеринемічними даніо пригнічує накопичення холестерину в плазмі, печінці та судинній системі шляхом зниження регуляції синтезу холестерину та ліпопротеїнів та регуляції синтезу жовчних кислот. Наші результати свідчать про те, що CPP можуть запобігти розвитку гіперхолестеринемії у людей і що прийом CPP може допомогти у лікуванні цього стану.

Інформація про авторів

Доктор філософії Шинічі Мегуро - старший головний науковий співробітник з досліджень та досліджень біологічних наук у корпорації Kao. Доктор Мегуро займається метаболізмом ліпідів, харчуванням та наукою про здоров’я.

Такахіро Хасумура - науковий співробітник з досліджень та досліджень - дослідження біологічних наук корпорації Kao. Дослідженням пана Хасумури є наука про здоров’я.

Тадаші Хасе DVM - віце-президент, відповідальний за наукові дослідження та дослідження біологічних наук у корпорації Kao. Доктор Хазе займається метаболізмом ліпідів, харчуванням та наукою про здоров’я.