Межі в мікробіології

Протимікробні засоби, резистентність та хіміотерапія

Редаговано
Патрік Р. Бутай

Школа ветеринарної медицини університету Росса, Сент-Кітс і Невіс

Переглянуто
Кетрін М. Лог

Університет Джорджії, США

ЖЕРОЕН ДЮФЛ

Гентський університет, Бельгія

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

дієти

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Удосконалена світлова та електронна мікроскопія (ZBS-4), Інститут Роберта Коха, Берлін, Німеччина
  • 2 Інститут мікробіології та епізоотиї, Центр інфекційної медицини, Університет Фрі Берлін, Берлін, Німеччина
  • 3 Мікробна геноміка (NG1), Інститут Роберта Коха, Берлін, Німеччина
  • 4 внутрішньолікарняні патогени та стійкість до антибіотиків, Інститут Роберта Коха, Вернігероде, Німеччина
  • 5 Інститут ветеринарної епідеміології та біостатистики, Freie Universität Berlin, Берлін, Німеччина
  • 6 Інститут Роберта Коха, Берлін, Німеччина

Вступ

Ентеротоксигенні кишкова паличка (ETEC) зазвичай асоціюються з діареєю після відлучення поросят (ПВЗ) у поросят, хворобою, що спричиняє серйозні втрати у свинарській галузі у всьому світі (Fairbrother et al., 2005; Rhouma et al., 2017a). В даний час застосовуються різні стратегії зменшення пов'язаних з ETEC економічних витрат у свинарстві, включаючи лікування пероральним сульфатом колістин в деяких регіонах світу (Rhouma et al., 2017b), вакцинацію (Moon and Bunn, 1993; Blázquez et al., 2018) та пробіотики (Li et al., 2018; Yan et al., 2018). Крім того, дієтичні добавки оксиду цинку високого рівня використовуються проти СІЗ у секторі свинарства (Fairbrother et al., 2005; Vahjen et al., 2011; Bednorz et al., 2013; Starke et al., 2014; Pieper et al., 2015; Kloubert et al., 2018).

Однак вплив дієт, багатих цинком, на популяції бактерій свинячого кишечника, особливо Кишкова паличка, ще не повністю зрозумілі. Цинк є другим за поширеністю перехідним металом у більшості філ і, як правило, вважається життєво важливим. Разом з міддю вона є важливим мікроелементом, необхідним для функції гормонів, розмноження, синтезу вітамінів, утворення ферментів, і вона сприяє сильній функції імунної системи (Yu et al., 2017). Обидва метали зазвичай додають у корм тваринам у кількості, необхідній для фізіологічної роботи організму (Yazdankhah et al., 2014; Yu et al., 2017).

Як двовалентний катіон (Zn 2+), цинк відіграє важливу роль як каталітичний та структурний кофактор практично у всіх аспектах клітинного метаболізму (Vallee and Auld, 1990). Дотримання збалансованого внутрішньоклітинного гомеостазу цинку є необхідною умовою для ссавців та більшості видів бактерій (Nies and Grass, 2009). Отже, кількість цинку в клітинах дуже регулюється, оскільки дефіцит цинку перешкоджає росту бактерій, тоді як надлишок цинку може бути токсичним (Gielda and DiRita, 2012). Фактори, що повідомляють, підвищують рівень толерантності до цинку в Кишкова паличка описані до цього часу включають катіонний засіб для дифузії (CDF) ZitB, P1b-типу ATPase ZntA та низькоафінний неорганічний фосфатний транспортер Pit (Beard et al., 2000; Grass et al., 2005; Deus et al., 2017; Hoegler and Hecht, 2018).

Наразі підвищена толерантність до (мікроелементів) металів, включаючи цинк, чітко пов'язана з генами, що надають стійкість до антибіотиків у різних видів бактерій (Cavaco et al., 2011; Agga et al., 2014; Medardus et al., 2014; Becerra -Castro et al., 2015; Song et al., 2017; van Alen et al., 2018), можливо, вказуючи на тривожний спільно-селективний ефект використання маси оксиду цинку (Seiler and Berendonk, 2012; Bednorz et al., 2013; Yazdankhah et al., 2014; Ciesinski et al., 2018). Отже, сучасне антропогенне забруднення навколишнього середовища важкими металами розглядається як серйозна проблема (Seiler and Berendonk, 2012).

В Кишкова паличка, розгалужена, тонко налаштована мережа викидних насосів, лігандів та факторів транскрипції бере участь у внутрішньоклітинній осмоадаптації та детоксикації важких металів, а також гарантує підтримку клітинного гомеостазу цинку (Hantke, 2005; Nies and Grass, 2009; Porcheron et al., 2013; Watly та ін., 2016). Недавні дослідження показали, що рівні толерантності до цинку відрізняються не тільки між видами бактерій, але і в межах певних видів, в тому числі Кишкова паличка людського та пташиного походження (Deus et al., 2017; Stocks et al., 2019).

Метою цієї роботи є вивчення впливу дієт, багатих цинком, на репрезентативно підібрану колекцію кишечника Кишкова паличка отримані від поросят після відлучення, враховуючи передбачувану асоціацію надлишку поживного оксиду цинку та (i) рівні переносимості цинозу до фенотипу, (ii) профілі чутливості до антибіотиків та біоцидів та (iii) гени, що беруть участь у протимікробній стійкості, цинк (важкі метали ) - і толерантність до біоцидів.

Матеріали і методи

Розмір вибірки та виділення ізоляту

Представницький набір Кишкова паличка Ізоляти, що досліджувались тут, були відібрані на основі попереднього випробування годування (Ciesinski et al., 2018), проведеного відповідно до принципів Базельської декларації відповідно до інституційних та національних рекомендацій щодо догляду та використання тварин. Протокол був схвалений місцевим державним управлінням охорони праці та технічної безпеки “Landesamt für Gesundheit und Soziales, Берлін” (LaGeSo Reg. Nr. 0296/13), як описано раніше (Ciesinski et al., 2018).

Коротко, 32 поросят ландрас, яких відлучили від доби на 25 ± 1 день, розділяли на дві групи протягом 4 тижнів: перша група поросят, позначена тут як група з високим вмістом цинку (HZG), годувалася раціоном, доповненим порівняно високою кількістю цинку оксиду (2 103 мг цинку/кг дієти), тоді як друга група служила контролем. Ця контрольна група (КГ) отримувала загальну дієту для поросят, що містить фізіологічну концентрацію оксиду цинку (дієта 72 мг цинку/кг), щоб уникнути недоїдання металевих металів (Ciesinski et al., 2018). Випробування розпочали з 32 поросят, яких принесли в жертву в середині випробування (38 ± 2 дні, n = 16) і в кінці (52 ± 2 дні, n = 16).

Тут ми зупинимося на Кишкова паличка отримані з зразків свиней, принесених у жертву в кінці (n = 16; 52 ± 2 дні) лише випробування на годування. Всього 817 Кишкова паличка зібрані з зразків фекалій, шлунково-кишкового тракту та слизової, отримані від цих останніх 16 свиней, зберігались у запасах гліцерину при −80 ° (Ciesinski et al., 2018). Використовуючи такі метадані, як місце відбору проб, група годівлі та оцінка росту на пластинах, що містять різні антибіотики, доступні для всіх 817 Кишкова паличка отриманий з цього початкового підходу (Ciesinski et al., 2018), ми відібрали стратифіковану випадкову вибірку, що включає 179 ізолятів (таблиця 1 та додаткова таблиця S1).

Таблиця 1. Поширення Кишкова паличка серед місць відбору проб, груп годівлі, свиней, MIC ZnCl2 та профілів стійкості до антибіотиків.

Характеристика фенотипу свиней Кишкова паличка

Випробування мікророзведення бульйону проводили для біоцидів та солей важких металів з використанням мікропланшетів (Merlin, Bornheim-Hersel, Germany), як описано раніше (Deus et al., 2017), включаючи алкілдіаміноетилгліцину гідрохлорид [ADH], бензетонію хлорид [BEN ], хлорид бензалконію [BKC], хлоргексидин гуанідину [CHX], акридинове з'єднання акрифлавін [ACR], сульфат міді [COP], нітрат срібла [SIL] і хлорид цинку [ZKC]. Кишкова паличка штами ATCC25922 та ATCC10536 використовували для внутрішнього контролю якості. На додачу, Кишкова паличка штам RKI6122 використовували як еталон для росту в присутності 1024 мкг ZnCl2/мл (Deus et al., 2017).

Проведено тестування на чутливість до антимікробних препаратів (AST) за допомогою системи VITEK ® 2 (BioMérieux, Німеччина; картка AST GN38), що включає амікацин, амоксицилін/клавуланову кислоту, ампіцилін, цефалексин, хлорамфенікол, енрофлоксацин, гентаміцин, марбофлоксацин, піцерацимін, піцерацимін/сульфаметоксазол відповідно до стандартів CLSI VET01-A4 та M100-S21) (Інститут клінічних та лабораторних стандартів, 2012, 2013).

Молекулярна характеристика Кишкова паличка

Сто сімдесят дев'ять Кишкова паличка секвенували за допомогою Illumina MiSeq ® 300 bp парного кінця секвенування цілого геному (WGS) з отриманим покриттям> 90X. Плазмідна ДНК Кишкова паличка RKI3099, ізолят, що представляє часто зустрічається геномний фон, пов’язаний із підвищеною толерантністю до цинку разом з антимікробною стійкістю (Додаткова таблиця S1), був виділений за допомогою міні-набору Qiagen Plasmid Mini відповідно до інструкцій виробника. Очищену плазмідну ДНК секвенували за допомогою платформи Pacific Biosciences RS II з хімією P6C4 в одному потоці клітин. Секвенування Pacific Biosciences було завершено шляхом створення бібліотеки секвенування від 5 до 20 kb за допомогою стандартних методів. Неопрацьовані дані PacBio та короткі зчитування Illumina були гібридно зібрані з використанням unicycler v4.4 (Wick et al., 2017). Для читання використовувались зчищені адаптером зчитування de novo складання в суміжні послідовності (contigs) і згодом у риштування за допомогою SPAdes v3.11. Всі чорнові геноми були анотовані за допомогою Prokka (Seemann, 2014).

У попередніх дослідженнях фактори описувались як здатні забезпечити підвищений рівень толерантності до цинку у Кишкова паличка (Grass et al., 2005; Deus et al., 2017; Vidhyaparkavi et al., 2017; Stocks et al., 2019). Отже, ми проаналізували наявність або відсутність широкого набору генів, що беруть участь у гомеостазі цинку (n = 35), включаючи цинкзв'язуючі металоферменти (n = 69) (Додаткова таблиця S2).

Оскільки спільний відбір стійкості до антибіотиків і металів є надзвичайно важливим питанням, і гени стійкості до металів часто розташовуються на мобільних генетичних елементах (MGE) поряд з генами стійкості до антибіотиків (ARG) (Baker-Austin et al., 2006; Fard та ін., 2011; Holzel та ін., 2012; Fang та ін., 2016; Song та ін., 2017; Argudín та ін., 2019), ми додатково дослідили наявність генів, які, як відомо, асоціюються з будь-якими антибіотиками. або стійкість металу до мобільних генетичних елементів серед нашої колекції ізолятів (Додаткова таблиця S1).

Подальше дослідження включало скринінг 203 генів, описаних Pal та співавт. (2013), особливо відомо, що це пов’язано з підвищеною толерантністю або навіть стійкістю до різних біоцидів, наприклад акридинової сполуки акрифлавіну [ACR], бензалконію хлориду [BKC] та бензетонію хлориду [BEN]. Процедура скринінгу включала серед інших qacЕ, його варіант qacE (Δ1), qacL, цукЕ, ygiW, ymgB (додаткова таблиця S3) та інші оперони, які, як відомо, беруть участь у детоксикації важких металів (arsА Б В Г, cusABCF, merRT, pcoABCDE, pcoRS, сріблоABCEFP, сріблоRS, терBCDWZ, ygiW) поряд із їх регуляторними генами (Додаткова таблиця S3).

Отже, in silico скринінг цілого геному на всі ці гени, пов’язаний з антибіотикорезистентністю (ARG) [n = 2570 включених варіантів ARG], стійкість до біоцидів або толерантність до важких металів проводили за допомогою власного трубопроводу BLAST із загальним порогом ідентичності 95% ID та 90% мінімальною довжиною на основі ResFinder 3.1 (Zankari et al., 2012), CARD (Комплексна база даних про стійкість до антибіотиків, Jia et al., 2017) та BacMet (База даних про антибактеріальні біоциди та стійкість до металів; Pal et al., 2013).

Дані скринінгу цілого геному використовувались для подальшої характеристики генотипу, включаючи визначення типу мультилокусної послідовності (ST) за допомогою MLSTFinder 2.0 (Larsen et al., 2012), прогнозування серотипу (SerotypeFinder 2.0, Joensen et al., 2015) та появу груп несумісності плазмід з PlasmidFinder 2.0 з порогом 95% ідентифікатора (Carattoli et al., 2014). Детальний огляд усіх ізолятів та характеристик наведено в додатковій таблиці S1.

Цілі послідовності геному для всіх 179 Кишкова паличка депонуються в NCBI-Genbank, а номери приєднання наводяться в додатковій таблиці S4.

Статистичний аналіз

Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення SPSS версії 25.0 (IBM, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США). P-значення Ключові слова: кишкова паличка, цинк, антимікробна стійкість, стійкість до свиней, важких металів

Цитата: Йоганнс В.К., Газісаєді Ф, Еппінг Л, Семмлер Т, Любке-Беккер А, Пфайфер Ю, Бете А, Айххорн І, Мерле Р, Вальтер Б і Вілер ЛГ (2019) Ефекти чотиритижневого високодозованого оксиду цинку Доповнена дієта на Комменсал кишкова паличка відлучених свиней. Спереду. Мікробіол. 10: 2734. doi: 10.3389/fmicb.2019.02734

Отримано: 16 липня 2019 р .; Прийнято: 11 листопада 2019 р .;
Опубліковано: 28 листопада 2019 р.

Патрік Рік Бутай, Ветеринарна школа університету Росса, Сент-Кітс і Невіс

Джерун Девульф, Університет Гента, Бельгія
Кетрін М. Лог, Університет Джорджії, США