PGC1A регулює співвідношення IRS1: IRS2 під час голодування, щоб впливати на печінковий обмін після інсуліну

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Запис ORCID для Дженніфер Л. Есталл
Для листування: [email protected]

Відредаговано Марком Монміні, Інститут біологічних досліджень The Salk, Ла-Хойя, Каліфорнія, та затверджено 18 січня 2019 року (отримано на огляд 2 вересня 2018 року)

Значимість

Печінка відіграє вирішальну роль у контролі гомеостазу глюкози під час циклу швидкого годування. Він реагує на інсулін та глюкагон, щоб або зберігати, або забезпечувати глюкозою інші органи. Інсулінорезистентність є відмінною рисою таких метаболічних захворювань, як діабет 2 типу та неалкогольна жирова хвороба печінки. Було встановлено взаємозв'язок між низьким рівнем печінкового рівня активованого проліфератором пероксисоми гамма-коактиватором 1-альфа (PGC1A) та печінковою резистентністю до інсуліну, проте основні механізми невловимі. Ми показуємо, що PGC1A контролює печінкове співвідношення субстратів рецепторів інсуліну 1 (IRS1) та експресії IRS2, що має вирішальне значення для визначення точного сигналу інсуліну в гепатоцитах для відповіді на голодування та годування. Важливо, що PGC1A є ключовим фактором для опосередкованого інсуліном придушення виробництва печінкової глюкози.

Анотація

Гамма-коактиватор 1-альфа-рецептора, що активується проліфератором пероксисоми (PGC1A), є транскрипційним коактиватором у сімействі, що включає двох інших членів: гамма-коактиватор 1-бета (PGC1B), що активується проліфератором пероксисоми, і гамма-коактиватор, пов'язаний з проліфератором пероксисоми 1 (PPRC1), які пов'язують фактори транскрипції для посилення експресії багатьох генів, що беруть участь у метаболізмі поживних речовин (4). PGC1A регулює реакцію печінки на голодування, сприяючи глюконеогенезу (5), катаболізму ліпідів (6) та детоксикації активних форм кисню, що утворюються мітохондріями (7). Зниження експресії PGC1A пов'язане з печінковою резистентністю до інсуліну при цукровому діабеті та НАЖХП у людини (8 ⇓ –10). Моделі мишей припускають, що фізіологічне зниження PGC1A порушує передачу сигналів про інсулін у печінці (6, 7), а миші з низьким рівнем печінки PGC1A більш сприйнятливі до стеатозу печінки та гіпертригліцеридемії, що є ознаками резистентності до інсуліну (6, 11, 12).

До цього часу було незрозуміло, чи зміни в печінковій чутливості до інсуліну, пов’язані з активністю PGC1A, зумовлені ефектами на мітохондріальний та/або метаболізм жирних кислот, що посилюють накопичення ліпідів та окислювальну шкоду (6, 7, 11 ⇓ 14 –14), або безпосередньою регуляцією генів які контролюють інсуліно-сигнальний шлях (15). Використовуючи моделі посилення та втрати функцій у первинних гепатоцитах миші, ми показуємо, що PGC1A регулює експресію багатьох компонентів сигнального шляху інсуліну в гепатоцитах, найголовніше, рівні IRS. Ми показуємо, що PGC1A впливає на баланс між експресією IRS1 та IRS2 у клітинах печінки, і як результат, коактиватор відіграє ключову роль в опосередкованому інсуліном контролі глюконеогенезу під час переходу натощак до годування.

Результати

Рівні PGC1A впливають на стимульоване інсуліном фосфорилювання AKT.

Суперечливі дані в різних моделях втрати функцій ускладнюють розуміння того, чи інгібує або активує PGC1A передачу сигналів інсуліну в печінці (6, 7, 15). Для вирішення цього питання ми оцінили різні аспекти інсулінового сигнального шляху, використовуючи дослідження посилення та втрати функції в первинних гепатоцитах миші. Парадоксально, але як повний нокаут, так і надмірна експресія PGC1A посилювали фосфорилювання AKT S473 у відповідь на інсулін (рис. 1 А і В). Збільшення фосфорилювання AKT відбулося не через компенсаторне збільшення PGC1B (7), оскільки індуковане інсуліном фосфорилювання AKT аналогічно збільшувалось у гепатоцитах мишей, яким бракувало обох коактиваторів (подвійні нокаути LA/BKO) (рис. 1C та Додаток SI, рис. S1A ). Відмінності у фосфорилюванні AKT також не були зумовлені посиленою сигналізацією рецептора інсуліну, оскільки рівень білка рецептора інсуліну та індуковане лігандом фосфорилювання (Y1146) не впливали на втрату PGC1A (рис. 1D). Надмірна експресія PGC1A дійсно призвела до зниження фосфорилювання інсулінових рецепторів у відповідь на інсулін, незважаючи на підвищений рівень p-Akt S473 та p-AKT T308 (рис. 1 B та E). Таким чином, хоча ці дані підтвердили PGC1A як важливий модулятор передачі печінкової інсулінової сигналізації, результати нелегко пояснити раніше описаними зв'язками між PGC1A та дією інсуліну (7, 15).

Рівні PGC1A впливають на стимульоване інсуліном фосфорилювання АКТ. Імуноблоти білка з первинних гепатоцитів миші, оброблених 100 нМ інсуліном протягом 15 хв (або вказаний час). Активація інсулінового сигнального шляху в гепатоцитах від (A і D) самців WT і LH (гетерозигота печінки-PGC1A) та LKO (печінка-PGC1A). (B та E) Гепатоцити, інфіковані аденовірусами, що експресують векторний контроль (AdCTL) або PGC1A або (C) специфічні для печінки миші PGC1A та PGC1B з подвійним вибиванням (LA/BKO). Всі експерименти проводились щонайменше два рази, і кожна смуга представляє окрему мишу.

Рівні PGC1A впливають на експресію генів ключових гравців інсулінової сигналізації.

Оскільки різні білки можуть прямо чи опосередковано регулювати фосфорилювання АКТ у відповідь на інсулін (2), ми припустили, що як транскрипційний коактиватор PGC1A може диференційовано контролювати експресію одного або багатьох із цих проміжних продуктів. Надмірна експресія PGC1A у первинних гепатоцитах суттєво підвищувала експресію Insr, Irs2, Mtor, Rictor, Raptor та Rheb, одночасно зменшуючи Irs1, Pi3kr1 та Deptor (рис. 2А). Як і очікувалось, змінений PGC1A/B змінив рівень мРНК генів, що контролюють мітохондріальні процеси (Додаток SI, рис. S1 B і C). Надмірна експресія PGC1B мала подібні ефекти на сигнальний шлях інсуліну, за винятком того, що рівні Insr, Rictor та Deptor залишались незмінними (рис. 2B). Взаємна картина експресії Irs спостерігалась у подвійних гепатоцитах KO PGC1A/B, при цьому значно зростала Irs1 та зменшувалась Irs2 (рис. 2C), тоді як Pi3kr1 та Rheb аналогічним чином зменшувались або втратою, або збільшенням експресії PGC1.

Рівні PGC1A впливають на експресію генів ключових членів інсуліно-сигнального шляху. Експресія гена qPCR в первинних гепатоцитах миші. Клітини WT, інфіковані аденовірусом, що надмірно експресують (A) PGC1A, (B) PGC1B або (C) первинні гепатоцити, виділені від мишей LA/BKO. Експерименти проводили щонайменше двічі з n = 4 ± SEM * P S473 у відповідь на інсулін (17) (Додаток SI, рис. S3), потенційно пояснюючи, чому спостерігалася переактивація АКТ після надмірної експресії (рис. 1B) та нокауту ( Рис. 1 A і C та 3B) PGC1A.

PGC1A регулює експресію білка IRS. Імуноблоти білка з первинних гепатоцитів обробляли 15 хв 100 нМ інсуліном. (A) Клітини, що мають надмірний векторний контроль (CTL), PGC1A або PGC1B. (B) Клітини мишей LA/BKO. (C) Співвідношення p-AKT до t-AKT у клітинах з надмірною експресією PGC1A або PGC1B (n = 4 ± SEM, виконано принаймні два рази).

PGC1A посилює експресію IRS2, стимульовану глюкагоном, через зв'язуючий білок елемента відповіді cAMP.

PGC1A підсилює експресію IRS2, стимульовану глюкагоном, через CREB. Первинні гепатоцити мишей, оброблені 40 нМ глюкагоном або носієм. (A) Експресія гена (n = 4 ± SE) та (B) імуноблоти з клітин, що експресують shControl або shPGC1A. (B, праворуч) Кількісне визначення двох експериментів (n = 5 ± SEM). (C) Імуноблот із гепатоцитів, коекспресуючий векторний контроль (CTL) або домінантно-негативний CREB (C-DN або CREBDN), домінантно-негативний TCF4 (T-DN або TCF4DN) або PGC1A, як зазначено. (Вправо) Кількісне визначення двох експериментів (n = 5 ± SEM). (D) мРНК у первинних гепатоцитах, що експресують CREB DN або контрольний вектор. (E) Імуноблоти з первинних гепатоцитів, попередньо оброблених глюкагоном або без них (40 нМ, 4 год) та оброблених інсуліном (100 нМ, 15 хв). * P 2 = 0,61, P 2 = 0,58, P 2 = 0,26, P = 0,01 відповідно). Рівні Irs1 не суттєво корелювали з вираженням будь-якого з цих факторів транскрипції (Додаток SI, рис. S5). Хоча ми відзначали позитивну кореляцію між Epas1 та Irs2, рівні Epas1 (HIF2A) у печінці зростають постпрандіально, щоб придушити дію глюкагону (29), - тимчасові рамки, коли PGC1A та IRS2 є найнижчими (17, 30). Таким чином, ми зосередили увагу на TCF4 та CREB як потенційних партнерах PGC1A у посиленні експресії IRS2.

Щоб визначити, чи необхідні TCF4 або CREB для осі глюкагон/PGC1A/IRS2, ми оцінили здатність глюкагону та PGC1A індукувати IRS2 у присутності домінантно-негативного TCF4 (31) або CREB (21). Експресія домінантно-негативного TCF4, індукована глюкагоном та PGC1A, не впливала на експресію домінантно-негативного TCF4, але суттєво знижувалась через пригнічення активності CREB (рис. 4C), що узгоджується із зменшенням індукованої глюкагоном експресії гена Irs2 шляхом домінантно-негативного CREB ( 4D). Таким чином, контроль експресії IRS2 глюкагоном та PGC1A залежав від активності CREB. Перед годуванням рівень глюкагону високий, а інсуліну низький. У цьому стані наші дані свідчать про те, що активація осі глюкагон/PGC1A зміщує співвідношення IRS1: IRS2, збільшуючи кількість IRS2, доступного для рецептора інсуліну, та готуючи печінку до відповіді на інсулін після їжі. Відповідно, коли первинні гепатоцити попередньо обробляли глюкагоном, індуковане індуковане фосфорилювання АКТ було збільшено (рис. 4Е).

Індуковане придушення печінкового глюконеогенезу регулюється віссю PGC1A/IRS2.

Індуковане придушення глюконеогенезу гепатоцитів регулюється віссю PGC1A/IRS2 in vitro та in vivo. (А) Інсуліно-опосередковане (100 нМ, 1 год) придушення глюкагон-індукованого (1 нМ, 1 год) глюконеогенезу (ГНГ) у первинних гепатоцитах, що надмірно експресують вектор, IRS1 або IRS2 (n = 8 ± SEM). * P ⇓ –14). Однак інтерес до розробки терапевтичних засобів, що підвищують PGC1A, може бути пом'якшений через побоювання збільшення PGC1A в печінці, що сприяє неправильному виробленню глюкози. Наші дані показують, що PGC1A модулює кілька шляхів у гепатоцитах для контролю виробництва глюкози, припускаючи, що цей потенційний згубний результат може бути необгрунтованим.

Несподівано змінені рівні PGC1A та PGC1B впливали на експресію генів численних членів шляху mTOR. Оскільки зміни генів не відображались на рівні білка, і ми виявили чіткий зв'язок між активатором коактиватора PGC1A, експресією IRS та активацією AKT, ми не досліджували, чи мають модифікації експресії гена mTOR функціональні наслідки на шляху. Дослідження показують, що активність mTOR в першу чергу впливає на статус фосфорилювання IRS1 та IRS2, а не на рівень його експресії (34, 35). Цікаво, що Уайт та співавтори (34) показують, що в режимі живлення (коли PGC1A низький) IRS2 руйнується від mTOR-залежного шляху. Отже, зміни білка DEPTOR (інгібітор mTOR), зумовлені PGC1A, можуть представляти зручний механізм зворотного зв’язку для контролю деградації IRS2 під час голодування. Подальші дослідження потребують розкриття механістичних зв’язків між PGC1A та mTOR, що також може ускладнитися впливом PGC1A на метаболіти, що сприймаються AMPK та mTOR (36).

Хоча ми можемо спекулювати на фізіологічному впливі зміни співвідношення IRS1: IRS2, подальші дослідження є виправданими для розшифровки точних біологічних функцій цих ефекторів рецепторів інсуліну в гепатоцитах. Недавнє дослідження коричневої жирової тканини показує, що надмірна експресія IRS1 або IRS2 має широкі та відмінні результати сигналізації (39). Попередні дослідження на мишах-нокаутах IRS (17, 18, 22, 40, 41) елегантно описують вимоги IRS до енергетичного метаболізму всього тіла під час переходу, який здійснюється натощак, проте автономний клітинний ефект на метаболічні процеси в печінці все ще залишається непевна. Таким чином, хоча ми демонструємо залежність від PGC1A для регулювання експресії IRS1 та IRS2 у клітинах печінки миші, точні наслідки цього на метаболізм глюкози та ліпідів у печінці в цілому після інсуліну досі в основному невідомі.

Цікаво, що ми показуємо, що як PGC1A, так і PGC1B зменшують експресію IRS1, тоді як лише PGC1A керує експресією IRS2. Це підкреслює важливу функціональну різницю між цими структурно спорідненими коактиваторами, які мають багато цільових цілей, але, схоже, також мають унікальну роль у метаболізмі глюкози та ліпідів у печінці (42). Що важливо, вважається, що PGC1B відіграє більш значну роль у ліпогенезі (43). Наші дані, що демонструють, що PGC1A та PGC1B мають диференційований вплив на ключові модулятори сигналізації рецепторів інсуліну, можуть допомогти пояснити відмінності та зрозуміти вплив цих коактиваторів на гомеостаз печінкової енергії. Однак, хоча ми показуємо, що CREB важливий для здатності PGC1A індукувати IRS2, механізм, за допомогою якого PGC1 зменшують експресію Irs1 в гепатоцитах, ще не визначений.

Підводячи підсумок, ми показуємо, що PGC1A взаємно регулює експресію білка IRS і опосередковує індукцію IRS2 у відповідь на глюкагон, що важливо для адаптації печінки до голодування та переходу в насичений стан. Це проливає нове світло на вплив PGC1A на інсуліно-сигнальний шлях та потенційно на патології, що виникають внаслідок порушення регуляції IRS-залежної передачі сигналу.

Матеріали і методи

Тварини.

Умовні специфічні для печінки Ppargc1a, Ppargc1b та Ppargc1a f/f: мишей Ppargc1b f/f KO генерували та підтримували, як описано раніше (7) (Додаток SI, Додаткові методи). Усі експерименти були схвалені та проведені відповідно до Інституту дослідницьких клінік Монреаля інституту з тваринництва та догляду за тваринами.

Первинне виділення гепатоцитів та культура.

Первинні гепатоцити мишей від мишей чоловічої та жіночої статі від 10 до 12 тижнів були виділені шляхом перфузії колагенази/градієнтного очищення перколлом та заражені аденовірусами, як описано раніше (6). Щодо відповідей інсуліну або глюкагону клітини інкубували протягом ночі у середовищах із високим вмістом глюкози (25 мМ), де бракувало дексаметазону та інсуліну. Інсулін та глюкагон додавали у зазначених концентраціях та за часом.

Метаболічний фенотип In vivo.

Рівні глюкози в крові та інсуліну в плазмі крові вимірювали через ніч (16 год) швидко або через 1 год після повторного годування. Для тестування на толерантність до пірувату піруват натрію (2 мг/кг) вводили внутрішньочеревно після голодування протягом ночі, і глюкозу в крові вимірювали у зазначений час. Для надмірної експресії самцям мишей вводили хвіст-вену, що експресує аденовірус, що експресує вектор (контроль), або кДНК PGC1A (2 × 10 9 інфекційних одиниць) з відновленням протягом 1 тижні перед тестуванням.

Придушення глюконеогенезу та аналізи глюкози.

Первинні гепатоцити переводили на основне середовище (DMEM з 0,2% BSA та 1 мМ глутаміну, без глюкози, червоного фенолу або NaPyruvate) протягом 1 години, щоб викликати глікогеноліз та виснажити глікоген (44). Основні середовища, що містять 10 мМ лактату та 1 нМ глюкагону (для сприяння глюконеогенезу) та 100 нМ інсуліну (для перевірки реакції на інсулін), обмінювались та збирали щогодини протягом 3 годин. Вивільнення глюкози вимірювали ферментативною реакцією (аналіз гексокінази # GAHK20 Sigma-Millipore) і нормалізували до вмісту білка в лунці.

Імуноблотинг.

Білки виділяли в буфер для аналізу радіоімунопреципітації, що містить інгібітори протеази та фосфатази (Roche). Зразки розщеплювали за допомогою SDS/PAGE, промокали і зондували антитілами, перерахованими в Додатку SI, Додаткові методи.

Експресія генів.

Загальну РНК, виділену TRIzol, оброблену ДНКазою I, реверс-транскрибували, і кДНК кількісно визначали за допомогою qPCR у реальному часі (Vii7), використовуючи SYBR Green. Дані нормалізували за допомогою методу ΔΔCt до мРНК гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази (Hprt) і виражали щодо контролю. Послідовності праймерів представлені в Додатку SI, таблиці S1.

Статистичний аналіз.

Статистичний аналіз проводили за допомогою GraphPad Prism. Односторонній (одноваріантний) або двосторонній (двоваріантний) ANOVA супроводжувався тестуванням post hoc (Sidak), виправленим для множинних порівнянь.

Подяка

Векторів люб’язно надали доктори. С. Го (IRS1 та IRS2), Л. Алонсо (shIRS2), М. Монтміні (CREB DN), Б. Шпігельман (PGC-1B) та Т. Джин (TCF4 DN). Ця робота була підтримана грантами Канадського інституту досліджень охорони здоров’я (SVB-145591) та корпорації Merck, Sharpe & Dohme (J.L.E.). П.Л.-Д. була підтримана стипендією випускника Монреальського дослідницького центру діабету; S.J. доктором Жана Куту (Інститут дослідницьких клінік Монреаля); та J.L.E. від Chercheur-boursier (Junior 2) з Фонду Recherche de Québec Santé.

Виноски

↵ 1 Кому слід адресувати листування. Електронна адреса: jennifer.estallircm.qc.ca .

Внески автора: A.B.-P. та J.L.E. розроблені дослідження; A.B.-P., S.J., P.L.-D., B.S., M.L. та J.L.E. виконані дослідження; A.B.-P., S.J., P.L.-D., B.S., M.L. та J.L.E. проаналізовані дані; та А.Б.-П. та J.L.E. написав роботу.

Автори не заявляють конфлікту інтересів.