Кетогенез запобігає індукованому дієтою пошкодження печінки та гіперглікемії

Девід Г. Коттер, 1,2 Баріс Еркаль, 1 Сяодзін Хуан, 1,3 Джеймісон М. Лейд, 1 Д. Андре д'Авіньон, 3 Марк Дж. Грем, 4 Денніс Дж. Дітцен, 2 Елізабет М. Брант, 5 Гері Дж. Патті, 3,6 та Пітер А. Кроуфорд, 1,6,7

1 кафедра медицини, Центр серцево-судинних досліджень, 2 кафедра педіатрії та 3 кафедра хімії Вашингтонського університету, Сент-Луїс, штат Міссурі, США. 4 Isis Pharmaceuticals Inc., Карлсбад, Каліфорнія, США. 5 кафедра патології та імунології та 6 кафедра генетики, Вашингтонський університет, Сент-Луїс, штат Міссурі, США. 7 Медичний дослідницький інститут Санфорда-Бернхема, Орландо, Флорида, США.

Адреса кореспонденції: Пітер А. Кроуфорд, Санфорд-Бернхемський медичний дослідницький інститут, 6400 Sanger Rd., Орландо, Флорида, 32827, США. Телефон: 407.745.2135; Електронна адреса: [email protected].

Примітка про авторство: Девід Г. Коттер та Баріс Еркал зробили однаковий внесок у цю роботу.

Знайдіть статті д’Авіньона, Д. у: JCI | PubMed | Google Scholar

Примітка про авторство: Девід Г. Коттер та Баріс Еркал зробили однаковий внесок у цю роботу.

Знайдіть статті Дітцена Д. у: JCI | PubMed | Google Scholar

Примітка про авторство: Девід Г. Коттер та Баріс Еркал зробили однаковий внесок у цю роботу.

Примітка про авторство: Девід Г. Коттер та Баріс Еркал однаково сприяли цій роботі.

Знайдіть статті Кроуфорда, П. у: JCI | PubMed | Google Scholar

Опубліковано 27 жовтня 2014 р. - Докладніше

Безалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) та неалкогольний стеатогепатит (НАСГ) в даний час є найпоширенішими причинами захворювань печінки в західних країнах (1). Індукована НАЖХП печінкова недостатність є однією з найпоширеніших причин трансплантації печінки. НАЖХП підвищує ризик розвитку діабету 2 типу, погіршує глікемічний контроль та сприяє патогенезу серцево-судинних захворювань та хронічних захворювань нирок (2 - 4). Патогенні механізми НАЖХП та НАСГ до кінця не вивчені, але вважається, що вони включають порушення метаболізму гепатоцитів, аутофагію гепатоцитів та стрес ендоплазматичного ретикулума, функцію печінкових імунних клітин, запалення жирової тканини та системні медіатори запалення (2, 4 - 6). Порушення вуглеводного, ліпідного та амінокислотного обміну відбуваються і сприяють ожирінню, діабету та НАЖХП у людей та в модельних організмах (розглянуто в посиланнях 7 - 11). Хоча аномалії гепатоцитів у метаболізмі ліпідів цитоплазми зазвичай спостерігаються при НАЖХП (12), роль мітохондріального метаболізму, який визначає окислювальне та кінцеве «знешкодження» жирів, у патогенезі НАЖХП менш чітка. Тим не менше, більшість дослідників сходяться на думці, що аномалії мітохондріального метаболізму виникають і сприяють розвитку НАЖХП (розглянуто в посиланнях 13-15).

За допомогою не повністю визначених механізмів гіперінсулінемія, пов’язана з ожирінням, пригнічує кетогенез, створюючи стан відносної кетогенної недостатності та приводячи до гіпокетонемії у моделей тварин із ожирінням та у людей у порівнянні з худими контролями (24–29). Для перевірки гіпотези про те, що порушення кетогенезу, навіть у вуглеводних і, таким чином, «некетогенних» станах, сприяє аномальному обміну глюкози та провокує стеатогепатит, ми створили мишачу модель вираженої кетогенної недостатності та застосували додаткові системні фізіологічні підходи та 13 С-маркування. засновані на вимірах високої роздільної здатності метаболічної динаміки для характеристики широкомасштабних ефектів кетогенного порушення.

Кетогенна недостатність спричиняє порушення печінкового обміну глюкози та ліпідів. Здатність кетогенезу впливати на печінковий гомеостаз глюкози та ліпідів була лише попередньо охарактеризована. Для визначення наслідків порушеного кетогенезу протягом висококетогенного періоду новонародженості мишам-сисунам вводили с.к. (25 мг/кг) з Hmgcs2-цільовий антисмисловий олігонуклеотид (ASO) щодня, починаючи з другого дня позаутробного життя. Порівняно з односмітниками, яким вводили контрольований ASO з контрольованою послідовністю, ми виявили, що лікування ASO HMGCS2 зменшило кількість печінкового білка HMGCS2 на 70% до постнатального дня 12 (P12) (Рисунок 1A). Ці миші демонстрували нормальну масу тіла та концентрацію глюкози в крові та демонстрували незначно знижену концентрацію кетонових тіл у плазмі крові (0,9 ± 0,05 мМ проти 1,3 ± 0,17 мМ у контролі, n = 4–6/група, P 30 та додаткові рисунки 1, C та D). Імунореактивний HMGCS2 елімінували з печінки у мишей, оброблених HMGCS2 ASO (рис. 1D). Обробка ASO не зменшила кількість білка цитоплазматичної 3-гідроксиметилглутарил-КоА-синтази (HMGCS1), яка каталізує передостанню реакцію в синтезі мевалоната (Додаткова фігура 1E).

Зближення кетогенної недостатності або з гострим надходженням жирних кислот, або з хронічним впливом "некетогенного" (не обмеженого вуглеводами) ВЧД призводить до додаткових метаболічних наслідків (рис. 8, праворуч), які роз'єднують підвищену доступність жиру від посиленого глюконеогенезу за допомогою механізмів, які можуть бути пов’язаним із секвестрацією вільного CoASH, критичного побічного продукту кетогенезу. Тому, незважаючи на посилену алостеричну активацію карбоксилювання пірувату, глюконеогенез погіршується через механізми, які можуть бути пов'язані зі зменшенням доступності CoASH. CoASH, що виділяється кетогенезом, є критично важливим у станах доставки жиру, зокрема, слугуючи субстратом для реакції α-KG дегідрогенази, для підтримки функції гомеостатичного циклу TCA, який у гепатоцитах є ключовим регулятором глюконеогенезу. Що цікаво, загальний печінковий пул триацилгліцерину не розширився у печінці тварин, недостатньо кетогенезу яких годували HFD, порівняно з тим, що спостерігався у контрольних групах, що свідчить про відносне обмеження субстрату (наприклад, гліцерину), порушення активності цитоплазматичної ацилгліцерину трансферази або фосфатидата фосфатази або входження ацильних ланцюгів в інші синтетичні шляхи.

Дослідження асоціації та секвенування екзомів у цілому геному виявили взаємозв'язок між численними генами, що кодують медіатори ліпідного обміну, та NAFLD/NASH (64, 65). Варіації генів, що кодують кетогенні медіатори, включаючи HMGCS2, HMG-CoA-ліазу та βOHB-дегідрогеназу, ще не визначені як незалежні провісники патології печінки або діабету. Хоча дефіцит HMGCS2 дуже рідкісний у людей, загальний ферментативний дефіцит HMGCS2 асоціюється з дитячою гіпокетонемічною гіпоглікемією та стеатозом печінки (66-71). Важливо, що наші дослідження на мишах новонароджених показали, що часткова втрата активності HMGCS2 спричиняла виражений стеатоз печінки значно більше, ніж пропорційно зменшенню кетозу новонароджених, але не призводила до гіпоглікемії новонароджених або процвітання. Ці висновки піднімають можливість того, що генетичні поліморфізми, що дають підступні та витончені кетогенні дефекти, можуть приховано схильні до розвитку жирової хвороби печінки та підтверджують критичну роль регулювання, яку відіграє печінковий кетогенез у регуляції печінкового метаболізму.

Додаткову інформацію можна знайти в Додаткових методах.

Вимірювання споживання їжі, маси тіла та складу тіла. Споживання їжі контролювали, починаючи з 1-го дня лікування ASO для кожної клітини мишей. Споживання їжі вимірювали раз на тиждень протягом кожного експерименту і нормалізували до кількості мишей на клітку та кількості днів між вимірами, яка завжди становила 3 або 4 дні. На початку всіх експериментів мишей також зважували щотижнево. Масу тіла та склад тіла реєстрували після 4-годинного голодування (1000–1400), після чого їжу негайно повертали. Відсоток жиру та нежирної маси тіла визначали кількісно у дорослих неспокійних тварин за допомогою приладу EchoMRI (Echo Medical Systems).

Кількісне визначення метаболіту плазми. Параметри метаболізму сироватки та крові вимірювали у зразках, відібраних після 4-годинного голодування, як описано раніше (31).

Кількісне визначення тканинного метаболіту. Концентрації TAG в печінці кількісно визначали біохімічно з використанням екстракту печінки Фольча, як описано раніше (79). Концентрації CoASH в тканинах, NAD + та NADH вимірювали в тканинах печінки із замороженою та біопульверизованою тканиною. Для CoASH приблизно 75 мг тканини гомогенізували із застосуванням донзу на склі на склі в обсязі × 10 крижаної деіонізованої води. Гомогенатів було закручено на 15000 g протягом 20 хвилин при 4 ° C. Супернатанти переносили в чисті пробірки на льоду, а потім зневоднювали за допомогою вакууму на швидкості обертання. Тканинні гранули ресуспендували до 2 мг/мкл, а 20 мг тканини (10 мкл) завантажували в 96-лункову платівку для концентрацій CoASH та довголанцюгових ацил-CoA, використовуючи колориметричний аналіз (BioVision). Концентрації NAD + (H) вимірювали за допомогою колориметричного аналізу, що циклічно ферментує (BioVision).

Гістологія. Відразу після жертви зразки печінки збирали і фіксували у 10% нейтральному забуференному формаліні (Fisher Scientific) або кріоконсервували в суміші оптимальної температури різання (O.C.T .; Tissue-Tek).

Аналіз експресії генів. Кількісну оцінку експресії генів проводили за допомогою кількісної ПЛР в режимі реального часу з використанням методу ΔΔCt, як описано раніше (31), нормалізуючи до Rpl32, використовуючи послідовності праймерів, перелічені в додатковій таблиці 6.

Імуноблотинг. Імуноблоти для виявлення HMGCS2 (кролячий анти-mHMGCS; Santa Cruz Biotechnology Inc.), HMGCS1 (кролячий анти-HMGCS1; Thermo Fisher Scientific) та актину (кролячий антиактин; Sigma-Aldrich) проводили, як описано раніше (32).

Кількісне відображення долі субстрату на основі ЯМР. Нейтралізовані екстракти хлорної кислоти тканин готували та профілювали, використовуючи 13-відредагований протонний ЯМР, як описано раніше (32, 33).

Тандемний MS-аналіз ацилкарнітинів у крові. Складні ефіри карнітину вимірювали шляхом сканування попередників загального м/з 85 фрагмент карнітину в протоколі LC з оберненою фазою, з'єднаний з тандемною MS (MS/MS), як описано раніше (80).

Потім таблиця функцій була оброблена в R для пошуку функцій, чиї м/з відповідно до видів у шляху подовження жирних кислот, як описано в KEGG (38, 39). Було розглянуто питання збагачення міток 13 С у кожного виду шляхом групування ознак з однаковим часом зберігання (12 С і 13 С (1,00335 аму). Де кілька груп таких ознак, відомих як ізотопологи, відповідають одному виду ацил-КоА, вибір однієї групи, до якої віднесено вид, був зроблений на основі таких критеріїв: (а) мінімум 3 ізотопологи, представлені в групі; (б) статистично значуща різниця (P 13 міток С, які були б включені в цю молекулу. Ідентичність ацетил-КоА перевіряли за допомогою стандарту ацетил-КоА (Sigma-Aldrich), розчиненого в 1: 1 ACN/вода, із спостереженнями 808.1140 та 808.1127 м/з унікальні піки при часом утримування відповідно 37,9 та 40,0 хвилин. Потім сумарну інтенсивність цих піків та пов'язані з ними ізотопологічні групи визначали у екстрактах печінки контрольних та тварин, оброблених HMGCS2 ASO.

Для кількісної оцінки диференціального 13-маркування ідентифікованих особливостей описані вище файли mzXML були оброблені в R із використанням XCMS (84) та X 13 CMS (40), причому остання була модифікована для виявлення відмінностей у моделях збагачення 13 C метаболітів, вилучених [3- 13 C] контрольований піруватом/лактатом контроль проти печінки з дефіцитом HMGCS2 (на відміну від звичайного використання, при якому виявляються відмінності між неміченими та міченими зразками того самого біологічного типу). Структури збагачення визначаються як розподіл кількості метаболітів між різними ізотопологічними формами певного метаболіту. Відмінності в моделях визначались як зміни форми цього розподілу між біологічними типами зразків, наприклад недостатній контроль проти кетогенезу.

Мітохондріальна ізоляція та дихання. Дослідження ізоляції мітохондрій та дихання проводили та оцінювали, як описано раніше (79, 85).

Статистика. Аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software). Неспарений двостулковий студент т тести та двосторонній ANOVA, з корекцією Бонферроні для виправлення багаторазових порівнянь, використовувались за необхідністю, як зазначено у тексті та легендах рисунків. Дані представлені як середні значення ± SEM, якщо не вказано інше. A P значення менше 0,05 вважалося значущим, за винятком досліджень LC/MS, в яких a P значення менше 0,01 вважалося значущим.

Затвердження дослідження. Всі експерименти проводились з використанням протоколів, затверджених Комітетом з досліджень тварин Вашингтонського університету.