Зміни структури острівців підшлункової залози, метаболізму та експресії генів у мишей із ожирінням C57BL/6J, індукованих дієтою

Афілійований медичний відділ, Відділ ендокринології, діабету та метаболізму, Університет Пенсильванії, Медичний факультет Перелмана, Філадельфія, Пенсильванія, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ біохімії та біофізики, Університет Пенсильванії, Медичний факультет Перелмана, Філадельфія, Пенсильванія, Сполучені Штати Америки

Affiliation Bioinformatics Group, Penn Molecular Profileing Facility, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, Філадельфія, Пенсільванія, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ внутрішньої медицини, Центр діабету Стреліц, Медична школа Східної Вірджинії, Норфолк, Вірджинія, Сполучені Штати Америки

Медичний факультет, Відділ ендокринології, діабету та метаболізму, Університет Пенсільванії, Медичний факультет Перелмана, Філадельфія, Пенсільванія, США, Департамент внутрішніх хвороб, Діабет-центр Стреліц, Медична школа Східної Вірджинії, Норфолк, Вірджинія, Сполучені Штати Америки Штати Америки

Реган Роут,
Вандана Рао,
Ніколай М. Доліба,
Франц М. Матчинський,
Джон В. Тобіас,
Іден Гарсія,
Рексфорд С. Ахіма,
Юмі Імай

Цифри

Анотація

Цитування: Roat R, Rao V, Doliba NM, Matschinsky FM, Tobias JW, Garcia E, et al. (2014) Зміни структури острівців підшлункової залози, метаболізму та експресії генів у мишей із ожирінням C57BL/6J, спричинених дієтою. PLoS ONE 9 (2): e86815. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086815

Редактор: Катрін Медлер, Бременський університет, Німеччина

Отримано: 9 квітня 2013 р .; Прийнято: 19 грудня 2013 р .; Опубліковано: 5 лютого 2014 року

Фінансування: Дослідження було частково підтримано грантами Національного інституту охорони здоров'я (K08-DK071536 - YI), Інституту ожиріння та метаболізму діабету при Пілотному та техніко-економічному гранті Інституту Пенсільванії, P01-DK049210 (RSA), Діабет Дослідницький центр мишей з фенотипування та ядер біології острівців (P30-DK19525), Інституту прикордонних геном Пенна та грант Департаменту охорони здоров’я Пенсильванії (JT). Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Інсулінорезистентність, яка часто спостерігається при ожирінні, вважається фактором ризику розвитку діабету 2 типу (T2D) [1]. Однак невдача секреції інсуліну на панкреатичному острівці для компенсації резистентності до інсуліну є критичною патологією, яка в кінцевому рахунку призводить до T2D [2] - [4]. Критично важливу роль, яку острівці відіграють у патогенезі T2D, засвідчують дослідження з асоціаціями генів (GWAS), які виявили локуси сприйнятливості до T2D, частіше пов’язані з функціями острівців, ніж чутливість до інсуліну [5]. Більше того, вважається, що поступове погіршення T2D у людини є наслідком поступової втрати функціональної маси β-клітин [3]. Таким чином, існує сильний інтерес до розтину молекулярних шляхів, що призводять до зниження маси та функції β-клітин у T2D, особливо, оскільки хвороба залишається серйозною проблемою для охорони здоров’я з обмеженою кількістю ефективних методів лікування, щоб повернути патологію назад [6].

Матеріали і методи

Дослідження на тваринах

Експерименти виконувались відповідно до інструкцій Організаційного комітету з догляду та використання тварин із його схваленнями. 4-тижневих самців мишей BL6J (лабораторії Джексона) утримували n = 5/клітку при 12-годинному освітленні: темний цикл, при температурі навколишнього середовища 22 ° C, і дозволяли вільний доступ до їжі та води. Групи мишей годували нормальним гризуном для гризунів (NC) (4 ккал% жиру; 5001 від Lab Diet) або дієтою з високим вмістом жиру (HF) (45 ккал% жиру; D124551 від Research Diets, Inc.,). Мишей збирали для гістологічних досліджень та для ізоляції острівців через 14 тижнів на NC або HF дієті.

Гомеостаз глюкози in vivo

Масу тіла контролювали щотижня у мишей, які перебувають у свідомості, під час годування. Глюкозу в крові в хвості вимірювали глюкометром протягом дня під час годування за бажанням (One Touch Ultra; Lifescan, Johnson & Johnson). Тести на толерантність до глюкози проводили після голодування протягом ночі (16 годин). Після вимірювання глюкози в хвості крові вводили ІР 1,5 г/кг розчину глюкози, і в різний час брали кров хвоста. Для оцінки стимульованої глюкозою секреції інсуліну in vivo мишам голодували протягом 5 годин вранці, давали 3 г/кг глюкози, і 20 мкл хвостової крові отримували в зазначений час для вимірювання інсуліну методом ІФА (Crystal Chem Inc.) . Рівні інсуліну в сироватці крові також вимірювали в серцевій крові, отриманій під час жертви.

Аналіз розповсюдження

Мишей безперервно мітили бромодезоксиуридином (5-бром-2-дезоксиуридин, BrdU), забезпечуючи 1 мг/мл BrdU (Sigma-Aldrich) у питній воді протягом 2 тижнів [11]. Включення BrdU в β-клітини візуалізували шляхом імуногістологічного аналізу зібраної підшлункової залози, як описано нижче.

Гістологія

Ізоляція острівців та аналіз перифузії ex vivo

Мишей знеболювали пентобарбіталом натрію (50 мг/кг внутрішньовенно), а острівці підшлункової залози виділяли з використанням перетравлення колагенази з подальшим центрифугуванням градієнта щільності Фіколя, як було описано раніше [13]. Близько 100 свіжоізольованих острівців завантажили в перифузійний апарат і протягом 35 хв перифузували буфером Кребса (рН 7,4), що містить 2,2 мМ Ca 2+, 0,25% бичачого сироваткового альбуміну (BSA), 10 мМ HEPES і 3 мМ глюкози при % Атмосфери CO2 при 37 ° C, а потім буфер Кребса з 30 мМ глюкози протягом 20 хв. В кінці кожного експерименту острівці тестували на максимальну секрецію інсуліну, додаючи 30 мМ KCl до перифузату. Проби відбирали зі швидкістю 1 мл/хв для вимірювання інсуліну методом радіоімунологічного аналізу (Linco Research, Inc.) [13].

Споживання кисню

Екстракція РНК та аналіз експресії генів

РНК екстрагували зі свіжоізольованих острівців за допомогою набору RNeasy (Qiagen), а кДНК генерували SprintPowerScript для синтезу кДНК (Clontech), використовуючи 500 нг РНК острівців як матрицю. Експресію генів аналізували за допомогою системи виявлення послідовностей ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems) з комерційними праймерами для системи. Результати були виражені з використанням експресії гена 36B4 як внутрішнього стандарту.

Аналіз мікрочипів

Статистика

Дані представлені як середнє значення ± SEM. Відмінності між двома групами оцінювали за допомогою повторного вимірювання ANOVA або неспареного t-критерію Стьюдента. p Рисунок 1. Гомеостаз глюкози in vivo та секреція інсуліну в BL6J на дієті з високим вмістом жиру.

(A – C) Самців мишей Bl6J відлучали від звичайної гризи гризунів (NC, дієта жиру 4,5% ккал) або дієти з високим вмістом жиру (HF, дієти 45% ккал жиру) і дозволяли вільний доступ до їжі. Вага тіла (BW, A), рівень глюкози в крові у хвості (B) та рівень інсуліну в крові (C) визначали у зазначений час. (D – F) І.П. Тест на толерантність до глюкози проводили у мишей Bl6J на NC або HF дієті протягом 3 місяців. (D) Рівень глюкози в крові та (E) рівень інсуліну під час тесту. (F) Збільшення рівня інсуліну в сироватці крові виражалося, приймаючи значення на той час 0 як 100%. Дані є середніми ± s.e.m., (A – B), обидва n = 7, повторне вимірювання ANOVA p-го через 14-й тиждень на ВЧ-дієті (рис. 2F) та аналіз включення BrdU у β-клітини. Як показано на рис. 2E – F, загальне включення BrdU у β-клітини у 1-місячних мишей було в 10 разів вище, ніж у 4-місячних мишей як на HF, так і на NC дієтах, що підтверджує активну проліферацію β-клітин у молодих мишей [17]. Включення BrdU в клітини HF β було в 1,43 рази більше, ніж NC (p Рисунок 2. Морфометричним аналізом оцінювали острівці з HF, що годували BL6J.

(A) Порівнювали загальну площу β клітин на підшлункову залозу, (B) β клітинну масу та (C) середню площу окремого острівця на ділянках підшлункової залози від мишей, які харчувались нормальною гризою (NC) та дієтою з високим вмістом жиру (HF) площі окремого острівця показано в (D). 6 секцій для NC та 5 секцій для HF-мишей, що харчувались, аналізували на (A – B). Було проаналізовано 4 секції на групу від мишей, що годували NC та HF із загальною кількістю 448 острівців для NC та 653 острівців для HF (C – D). (E – H) Відсоток β-клітин, позитивних на антитіло до BrdU, порівнювали між мишами, які отримували NC та HF, мічених міткою BrdU у віці 1 місяця (E) та 4 місяця (F). 4 секції в групі аналізували на (E) та 5 секцій на групу на (F). Показані репрезентативні фотографії з острівця, позначеного віком 1 місяць на NC (G) та HF (H). Зелене фарбування: BrdU. Червоне фарбування: інсулін. Смуги шкали позначають 50 мкм. Дані є середніми ± s.e.m., n = 4–5 для (E) та (F). ** p Рисунок 3. Зміни секреторної та метаболічної функцій та експресії генів на острівцях із HF, що годується BL6J.

(А) Глюкозостимульована секреція інсуліну (GSIS) порівнювалася ex vivo між острівцями мишей на NC та ВЧ дієтах. Показані профілі секреції інсуліну, площа під кривою (AUC) секреції інсуліну та співвідношення першого та другого піків секреції інсуліну. (B) Порівняно споживання кисню між острівцями з NC та HF, інкубованими без глюкози (0), з подальшою обробкою 25 мМ глюкози (Glu), а потім карбонілціанід-4-трифторметоксифенілгідразоном (FCCP). (C) rtPCR порівнював регульований гіпоксією білок 1 (Hyou1), активований проліфератором пероксисоми гамма-коактиватор 1-альфа (Ppargc1a), колаген, тип I, альфа 1 (Col1a1) та експресія аспорину (Aspn) між острівцями від NC та HF груп. Результати були виражені з використанням експресії гена 36B4 як внутрішньої. Дані є середніми ± s.e.m., n = 4–5. * p 2+ [23], [28]. Ці аномалії можуть погіршити реакцію β-клітин на глюкозу, коли вони безперервно піддаються гіперглікемічним умовам in vivo (рис. 1Е). В якості альтернативи неврологічні та паракринні фактори можуть відігравати роль у притупленні секреції інсуліну, стимульованої глюкозою in vivo.

Наш аналіз мікрочипів визначив Pgc1α як один з генів, регульованих вгору на HF-острівцях. Також повідомлялося, що експресія Pgc1α на острівцях була підвищена на кількох моделях тварин, які збільшили попит на секрецію інсуліну, такі як миші ob/ob, миші після часткової панкреатектомії та щури Цукерського діабетичного жиру (ZDF). Однак регуляція експресії PGC1α та її функція на острівцях представляється складною. У цьому ж дослідженні було запропоновано, що PGC1α в острівцях негативно регулює секрецію інсуліну, оскільки примусова експресія Pgc1α на острівцях зменшує секрецію інсуліну [20]. У той же час повідомлялося, що експресія PGC1α корелює з вищою секрецією інсуліну на людських острівцях, мишах, які отримували стрептозотоцин, і щурах Гото-Какідзакі (GK) [29]. Оскільки зменшення PGC1α міРНК на дисперсних острівцях людини зменшує секрецію інсуліну, підтримка базальних рівнів PGC1α може бути необхідною для підтримки секреції інсуліну [29].

Hyou1 - ще один ген, який збільшується в HF-острівцях в нашому аналізі мікрочипів. HYOU1 є білком-шапероном ER, експресія якого зростає в різних тканинах при гіпоксії, але сильно експресується в печінці та β-клітинах підшлункової залози навіть при нормоксії [30], [31]. Вища експресія Hyou1 вважається захисною проти стресу ER і показала, що вона знижує резистентність до інсуліну при системному надмірному вираженні у мишей [32], [33]. Цікаво, що покращення ліпід-індукованого стресу ER в печінці шляхом активації шляху Sirt1/AMPK асоціюється з індукцією HYOU1 [34]. Існує кілька досліджень, що демонструють потенційну важливість HYOU1 у функціях острівців. Раніше протеомічне дослідження показало, що HYOU1 збільшується на T2D-острівцях людини порівняно з острівцями, що не мають діабету [19]. Більше того, зменшення Hyou1 зменшило глюкозо-стимульовану секрецію інсуліну в клітинах MIN6, підтримуючи його критичну роль у секреції інсуліну [35]. Таким чином, підвищена експресія Hyou1 на острівцях підшлункової залози може служити захисним механізмом при BL6J на ВЧ дієті.

Підводячи підсумок, ми провели морфологічні, секреторні, метаболічні та дослідження профілювання експресії генів, щоб охарактеризувати зміни в острівцях BL6J з мутацією NNT на ВЧ дієті. Ми спостерігали особливості, що демонструють поєднання компенсації острівців та функціональних порушень у цій широко використовуваній моделі T2D. Інформація, отримана в результаті нашого дослідження, допоможе інтерпретувати дослідження, що використовують BL6J з мутацією NNT як модель ожиріння, спричиненого дієтою, та полегшить переклад цих даних на дослідження у людини щодо T2D.

Довідкова інформація

Таблиця S1.

Список генів, регульованих вгору на HF-острівцях, порівняно з NC-острівцями при аналізі мікрочипів із використанням кратного відсікання змін ≥1,5 та коефіцієнта помилкового виявлення ≥0,13%.