Вплив вибору середовища та піногасника на виробництво та якість моноклональних антитіл за допомогою високопродуктивної мікробіореакторної системи

Сай Рашміка Велугула-Йеллела

1 Управління з контролю за продуктами та ліками США, Центр оцінки та досліджень лікарських засобів, Управління якості продукції, Управління біотехнологічних продуктів, Відділ огляду та досліджень біотехнологій II, Срібне джерело, доктор медичних наук,

середовища

Абаша Вільямс

1 Управління з контролю за продуктами та ліками США, Центр оцінки та досліджень лікарських засобів, Управління якості продукції, Управління біотехнологічних продуктів, Відділ огляду та досліджень біотехнологій II, Срібне джерело, доктор медичних наук,

3 Поточна адреса: VPPL/VRC/NIAID/NIH, Гейтерсбург, доктор медичних наук,

Микола Трунфіо

1 Управління з контролю за продуктами та ліками США, Центр оцінки та досліджень лікарських засобів, Управління якості продукції, Управління біотехнологічних продуктів, Відділ огляду та досліджень біотехнологій II, Срібне джерело, доктор медичних наук,

2 кафедра хімічного машинобудування, Університет штату Массачусетс, Лоуелл, Массачусетс,

Chih ‐ Jung Hsu

1 Управління з контролю за продуктами та ліками США, Центр оцінки та досліджень лікарських засобів, Управління якості продукції, Управління біотехнологічних продуктів, Відділ огляду та досліджень біотехнологій II, Срібне джерело, доктор медичних наук,

Бретань Чавес

1 Управління з контролю за продуктами та ліками США, Центр оцінки та досліджень лікарських засобів, Управління якості продукції, Управління біотехнологічних продуктів, Відділ огляду та досліджень біотехнологій II, Срібне джерело, доктор медичних наук,

Сонгкю Юн

2 кафедра хімічного машинобудування, Університет штату Массачусетс, Лоуелл, Массачусетс,

Кір Агарабі

1 Управління з контролю за продуктами та ліками США, Центр оцінки та досліджень лікарських засобів, Управління якості продукції, Управління біотехнологічних продуктів, Відділ огляду та досліджень біотехнологій II, Срібне джерело, доктор медичних наук,

Пов’язані дані

Анотація

Вступ

Моноклональні антитіла (mAb) є важливим класом лікарських препаратів, отриманих з біотехнологій, із затвердженими показаннями до лікування, починаючи від аутоімунних захворювань, ускладнень після трансплантації, артриту та лікування різних видів раку.1 Майже 70% усіх процесів виробництва рекомбінантних білків використовують клітини яєчників китайського хом'яка (CHO) через їх здатність виробляти білки зі схожими посттрансляційними модифікаціями до вродженого людського білка, легко адаптуються до середовищ, що не містять сироватки крові, і продемонстрували надійність як безпечні господарі2.

Через витрати та складності, пов’язані з комерційним виробництвом mAbs, існує великий попит на ефективну та економічну доставку стабільно високоякісної лікарської речовини. Хоча комерційний вихід моноклональних антитіл може регулярно давати від 5 до 6 г/л, клітинами CHO можна генетично маніпулювати для подальшого підвищення продуктивності.3 Збільшення вироблення білка пояснюється оптимізацією біопроцесу за рахунок розвитку середовища, умов культури клітин та посилені стратегії годування. Склад середовища є одним з найважливіших факторів у виробництві mAb, оскільки збалансований запас мікроелементів, таких як вітаміни, амінокислоти та мікроелементи, необхідні для підтримки правильного росту клітин та отримання високоякісного білка. 4, 5, 6

Крім того, важливим фактором, який може вплинути на процес біореактора, є вибір хімічних протипінних агентів або “піногасників”. Надмірне піноутворення може призвести до пошкодження білків внаслідок розриву бульбашок, втрати контролю над стерильністю системи від виходу піни та пов'язаного з тиском пошкодження обладнання внаслідок блокування вихідних фільтрів. частинки, олія або суміш цих компонентів.7 Гідрофобні тверді частинки можуть руйнувати піну через механізм зневоднення мосту, при якому гідрофобність частинки спричиняє перфорації на поверхнях піни, що призводить до її розриву. 10 Піноутворювачі на масляній основі аналогічним чином порушують піни через механізм зневоднення мосту, а також механізм розтягування мостів, при якому масло утворює містки в пінопластовій ламелі, що розтягується і призводить до розриву піни.

Попередні дослідження показали, що додавання піногасника може мати як позитивний, так і негативний вплив на ріст клітин, що згодом може вплинути на вихід білкового продукту. 11, 12, 13 Силіконові піногасники на основі полімеру негативно впливають на ріст клітин при біопроцесі вище подорожувати вниз за течією, де вони можуть засмічувати фільтри та створювати труднощі на етапах очищення. Крім того, протипінні взаємодіють із клітинними мембранами і можуть змінювати проникність, що призводить до витоку вмісту клітин і в кінцевому підсумку призводить до загибелі клітин. клітини можуть виникати, але це вважається найгіршим сценарієм.9 З огляду на широкий вибір комерційних антипінників, важливо вибрати склад, який відповідає потребам біопроцесу.9

Метою цього дослідження було оцінити декілька комбінацій комерційно доступних середовищ та піногасника для їх впливу на ріст клітин та питому продуктивність внутрішньої клітинної лінії CHO-DG44, що виробляє модельний химерний IgG1. Ми використовували автоматизований мікробіореактор ambr®15 (Sartorius, Хартфордшир, Великобританія), що складається з 48 паралельних мікробіореакторів, які, як було доведено, можна порівняти з класичними реакторами з перемішуваними резервуарами в масштабних дослідженнях. визначати вплив на ріст клітин та вироблення антитіл. На підставі попередніх партій, вибір середовищ та піногасника був звужений до трьох піногасників та трьох середовищ, зберігаючи OptiCHO як еталонний/базовий носій. Хоча оптимізація медіа-стратегій вимагає глибокого розуміння процесу та потреб у харчуванні, надзвичайно цінним є усунення поганих показників та шкідливих піногасників, які могли рекламувати додатки для широкого кола клітинних ліній СНО (наприклад, суспензія DG ‐ 44 або CHO). та швидко звузити медіа-кандидатів для нашої конкретної моделі системи культури клітин.

Матеріали і методи

Реагенти для культури клітин

Хімічно визначене (CD) середовище OptiCHO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) було оригінальним середовищем, в якому розповсюджувалася клітинна лінія. Клітини були адаптовані до чотирьох інших комерційно доступних середовищ, включаючи CD Dynamis (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Каліфорнія), безбілковий ProCHO 5 (Lonza, Walkersville, MD), CD PowerCHO 2 (Lonza, Walkersville, MD) та CD EX ‐ Cell Advanced (SAFC, Lenexa, KS). Всі досліджені середовища були доповнені 8 мМ L-глютаміном (Corning, Manassas, VA) та 1X пеніциліном/стрептоміцином (Corning, Oneonta, NY). Початкова концентрація глюкози в кожному середовищі варіювалась, залежно від власного складу виробника, і становила від 5 до 8 г/л. ProCHO 5 та EX-Cell Advanced мали найвищу концентрацію глюкози, тоді як OptiCHO мали найнижчу концентрацію глюкози. Було вивчено п’ять комерційних піногасників (Sigma Life Sciences, Сент-Луїс, Міссурі): Antifoam C, Antifoam EX ‐ Cell, Antifoam 204, Antifoam SE ‐ 15 та Antifoam Y ‐ 30. РН культури клітин контролювали за допомогою 1М NaOH (Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ).

Розширення насіннєвого поїзда

Власний, химерний IgG1, що продукує клітинну лінію CHO DG44, культивували в п’яти тестових середовищах. Культури колби для струшування (30 мл) витримували в інкубаторі, контрольованому при 37 ° C і 8% CO2, і перемішували зі швидкістю 130 об/хв. На третій день клітини в кожному середовищі підкультивували у 125-мл одноразову спіннерську колбу (Corning), що містить свіжі середовища. Культури блешні інкубували в тих же умовах, що і шейкерні колби, і перемішували зі швидкістю 70 об/хв. До культур блешні додавали додаткові свіжі середовища на третій день (за день до приготування інокулятів) для підтримки життєздатності клітин вище 90% при максимальному обсязі 125 мл.

Пакетний процес мікробіореакторної системи

Культури періодичних зразків для всіх експериментів зберігали в 15-міліметровій вдосконаленій мікрореакторній біореакторній системі, що складалася з 48 одноразових посудин (іспарених або не-іспарених) на 4 робочих станціях. Задані значення процесу в кожній посудині були однакові: розчинений кисень (DO) 50%, рН 7,1 ± 0,05, температура 37 ° C і швидкість перемішування 1000 об/хв. Обробник рідини забезпечував автоматичну зарядку середовища, інокуляцію, відбір проб та додавання піногасника та NaOH. Після інокуляції 0,5 або 106 клітин/мл або 1 × 106 клітин/мл об’єм культури підтримували вище 10 мл. Щільність життєздатності клітин та життєздатність клітин вимірювали щодня за допомогою автоматизованого та інтегрованого аналізатора життєздатності клітин Vi-Cell XR (Beckman Coulter, Brea, CA). Щоденні проби брали з кожної посудини для аналізу поживних речовин (глюкози, глутаміну та лактату) за допомогою аналізатора BioProfile FLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA). Основу (1 М NaOH) додавали по мірі необхідності для кожного окремого іскроносного посудини протягом усієї тривалості культури (8–9 днів).

Споживання поживних речовин та метаболічні побічні продукти розраховували лише для лінійної області фази експоненціального зростання; ця область була визначена візуальною оцінкою часової еволюції щільності клітин експертом клітинної культури. Потім була проведена лінійна регресія для всіх вимірювань, що потрапляють в цю область, і нахил результуючої лінії регресії приймається як швидкість споживання поживних речовин або швидкість накопичення побічних продуктів. Додатковий малюнок S3 показує приклад цієї процедури.