Вплив інгібітора ліпази підшлункової залози та сорбенту ліпідів на холестеринемію та фекальний вихід жиру у щурів

Анотація

Вступ

Експериментальний

Тварини та дієти

Було використано двадцять одну самку щурів Вістар, віком приблизно 6 тижнів. Щурів поселяли індивідуально у контрольованому температурою та вологістю віварії (22 ± 1 ° C, відносна вологість 60 ± 5%). Всі дієти доповнювали холестерином при 10 г кг -1 та кокосовим шротом при 124 г кг -1. Кокосова мука, що містить 56,5% жиру, була придбана в магазині здорової їжі.

У таблиці 1 представлений склад контрольної та експериментальної дієт. Дієта для щурів ST-1 поставлена ТОВ «Велаз» (м. Лисолає, Чехія). Через 4 тижні щурів випадковим чином розділили на три групи по 7 щурів у кожній. Дієта № 2 додавали орлістат у кількості 0,3 г кг -1. Дієта № 3 доповнювали амідованим альгінатом по 40 г кг -1 за рахунок целюлози. Дозування орлістату було середнім значенням концентрацій, використаних в експерименті Круз-Хенандеса та співавт. [11]. Дієта та вода були доступні за бажанням. В ході цього експерименту вимірювали початкову та кінцеву ваги тіла. У цьому експерименті середня початкова маса тіла щурів становила 240 ± 28 г. Дослідження було схвалено Комітетом з етики Інституту наук про тварин та Центральною комісією з питань захисту тварин Міністерства сільського господарства Чеської Республіки.

Склад контрольної та експериментальної дієти (г кг -1)

Тривалість експерименту становила 3 тижні, а потім щурів жертвували декапітацією після наркозу шляхом інгаляції ізофлурану (Nicholas Piramal India Ltd., Лондон, Великобританія). Щури отримували 4 г корму за 4 год до їхньої жертви [12].

Матеріали та реактиви

Натрієва сіль альгінової кислоти, продукт низької в'язкості A1112 із бурих водоростей, натрію мануронової кислоти, реагент 1-феніл-3-метил-5-піразолон (ПМП), орлістат, сертифікований еталонний матеріал (PHR 1445), мікрокристалічна целюлоза та N-октадециламін був придбаний у Sigma-Aldrich (Прага). Інші хімікати були придбані у P-Lab (Прага, Чеська Республіка). Натрієву сіль L-гулуронової кислоти було отримано від Carbosynth Ltd., Compton, UK.Набір Sylon HTP (гексаметилдисилазан-триметилхлорсилан-піридин 3: 1: 9) був придбаний у Supelco (Bellefonte, США). Ізолітохолева кислота, норхолева кислота, 12-кетолітохолева кислота, α-, β-, ω-мурихолева кислоти та β-ситостанол були придбані у компанії Steraloids Inc. (Ньюпорт, США). Інші стерини були отримані від Sigma-Aldrich (Прага).

Приготування амідованого альгінату

N-октадециламід альгінової кислоти отримували реакцією метил-естерифікованої альгінової кислоти з реагентом N-октадециламіну [13]. Реакцію з N-октадециламіном проводили в гетерогенних умовах. Продукт промивали підкисленим етанолом, петролейним ефіром, чистим етанолом та ацетоном і, нарешті, сушили на повітрі.

Аналітичні методи

Метод титрування для визначення карбоксильної групи

Вміст усіх карбоксильних груп COOHt (% м/м) в альгіновій кислоті та вміст вільних карбоксильних груп COOHf (% м/м) її метилового ефіру визначали методом титрування [14].

Органічний елементний аналіз та визначення ступеня заміщення

Вміст C, H та N (% м/м) визначали органічним елементним аналізом. Ступінь амідування (DA, мовляв.%) Кінцевих продуктів розраховували згідно з Taubner et al. [13], виходячи із вмісту вуглецю та азоту.

Аналіз молекулярної ваги

Реакція з органічними похідними динітро заснована на здатності зменшувати динітросаліцилову кислоту за рахунок відновлення полісахаридних груп [15]. Для калібрування використовували галактуронову кислоту.

Аналіз співвідношення мануронової та гулуронової кислот в альгінаті

Альгінат гідролізували, як описано Lu et al. [16] з деякими змінами. Дериватизацію уронових кислот проводили, як описано Dai et al. [17]. Та сама процедура застосовувалась для обробки стандартів моносахаридів та їх еквімолярної суміші. Відношення маннуронату до гулуроната розраховували за результатами подальшого аналізу C18 ВЕРХ-DAD (співвідношення площ піків, скориговане на фактори відповіді). Використовували аналітичну колонку C18 ZORBAX (компанія Agilent).

Відбір проб

Зразки змішаної крові відбирали у кожного щура під час забою. Зразкам давали постояти 30 хв. Сироватки відокремлювали центрифугуванням, зберігали в холодильнику та аналізували наступний день. Після лапаротомії печінку вирізали і тримали при -40 ° C до аналізу. Протягом останніх 5 днів цього експерименту фекалії збирали, зважували, об’єднували, заморожували та зберігали до аналізу.

Аналіз ліпідів сироватки, печінки та фекалій

Концентрації холестерину, триацилгліцеринів, білірубіну та активності аспартатамінотрансферази (AST) та аланінамінотрансферази (ALT) у сироватці визначали за допомогою комерційних наборів (BioVendor Ltd., Брно, Чеська Республіка). Загальні печінкові та фекальні ліпіди екстрагували сумішшю хлороформ-метанол та вимірювали гравіметрично [18]. Печінковий холестерин, нейтральні фекальні стерини та жовчні кислоти визначали, як описано раніше [10].

Інші аналізи

Профіль жирних кислот кокосової муки, вміст жиру в кокосовій муці та аналізи дієти ST-1 проводили, як описано Skřivan et al. [19]. Профіль жирних кислот в екскрементах проводили згідно з Marounek et al. [20]. Триацилгліцероли в кокосовій муці визначали, як описано Kobayashi et al. [21]. Ліпіди розчиняли в гексані, нерозчинні частинки видаляли центрифугуванням і супернатант вводили на колонку Luna ® 3 мкм C18 (2) 100 Å, LC для розділення гідрофобних сполук (Phenomenex, Torrance, США). Було використано апарат ВЕРХ Shimadzu, оснащений випарним детектором розсіювання світла. Була використана градієнтна програма на основі двох розчинників: перший розчинник складався з 98,9% гексану, 1% ізопропанолу та 0,1% оцтової кислоти. Другий розчинник містив 99,9% ізопропанолу та 0,1% оцтової кислоти. Метод відкалібрували за допомогою гліцерилтрипальмітату, розчиненого в гексані.

Статистика

Аналіз даних проводили за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA), використовуючи процедуру GLM SAS, версія 8.2 (SAS Institute, Cary, NC, США). Результати виражаються як середнє та стандартне відхилення. Істотні відмінності (Р -1. Після метилювання та амідування молекулярна маса кінцевого продукту зменшилася до 12,3 кг моль -1. Середнє значення співвідношення маннуронат/гулуронат, розраховане за результатами трьох аналізів, проведених у різні дні, становило 2,65 ± 0,05.

Характеристика альгінату, метилестера альгінової кислоти та амідованого альгінату

Характеристика пальмового жиру (кокосова мука)

У кокосовій муці основною жирною кислотою була міристинова кислота, а потім пальмітинова кислота та капринова кислота. Олеїнова кислота була основною ненасиченою жирною кислотою, присутньою в кокосовій муці (табл. 3). Кокосова мука містила 56,5% жиру, як визначено екстракцією петролейним ефіром. ВЕРХ-аналіз показав, що кокосова мука містить триацилгліцерини, виражені у вигляді трипалмітину при 623 мг г -1 .

Профіль жирної кислоти кокосової муки (г на 100 г жирних кислот)

Вплив орлістату та амідованого альгінату на показники сироватки та печінки та фекальні виділення жиру та стеринів у щурів

У щурів, яких годували дієтою, що містить 300 мг кг -1 орлістату, холестерину ЛПНЩ у сироватці крові, печінкового холестерину та ліпідів у печінці, значно зменшилося; однак загальний рівень холестерину в сироватці крові та триацилгліцеринів у сироватці крові були лише незначно знижені. Доповнення раціону щурів амідованим альгінатом значно зменшило загальний холестерин у сироватці крові, рівень холестерину ЛПНЩ у сироватці крові, а також концентрацію холестерину в тканині печінки та концентрацію печінкових ліпідів. (Таблиця 4).

Вплив орлістату та амідованого альгінату (г кг -1) на сироваткові та печінкові показники та фекальний вихід стеринів у щурів, яких годували дієтами 1, 2, 3.

Триацилгліцерини в сироватці крові суттєво корелювали із вмістом холестерину в сироватці крові (r = 0,610; P = 0,003) та незначно корелювали із загальними ліпідами печінки (r = 0,378, P = 0,091). Холестерин у сироватці крові суттєво корелював із вмістом холестерину в печінці (r = 0,804, P -4). Щоденне вироблення фекалій жиру суттєво зростало у щурів, яких годували дієтами, доповненими амідованим альгінатом та орлістатом. Амідований альгінат значно збільшив фекальні втрати копростанолу та загальних нейтральних стеринів. Вихід жовчної кислоти, концентрація білірубіну в сироватці крові та активність амінотрансфераз істотно не впливали.

Амідовані альгінат та орлістат модифікували профілі жирних кислот у виділених ліпідах. Концентрація насичених жирних кислот зменшилась, а концентрація ненасичених жирних кислот зросла (табл. 5).

Профіль жирної кислоти a у екскрементах щурів, яких годували контрольною дієтою та дієтами, доповненими орлістатом та амідованим альгінатом (г кг -1)

Обговорення

Альгінат - природний полісахарид, склад якого залежить від виду водоростей. Молекулярна маса та співвідношення маннуронат до гулуронат відіграють значну роль у фізико-хімічних властивостях альгінату [16]. Під час амідованого синтезу альгінату умови гідролізу кислоти спричинили зменшення середньої молекулярної маси. В експерименті Санчеса-Мачадо та співавт. [22], співвідношення маннуронат і гулуронат у п’яти видів морських водоростей коливалося від 2,3 до 4,3. Наші висновки (2,65 ± 0,05), таким чином, знаходились у цьому діапазоні.

Модифіковані полісахариди, що містять довгі вуглеводневі ланцюги, є ефективними сорбентами ліпідів, як показано в експериментах з амідованим пектином [23], амідованими целюлозами [24] та амідованим альгінатом [10]. У цьому експерименті у щурів, яких годували амідованим альгінатом, концентрація холестерину в сироватці крові та печінці знижувалась, а вихід фекалій жиру, холестерину та копростанолу (метаболіту холестерину) збільшувався. Низька концентрація печінкового холестерину у щурів, яких годували експериментальними дієтами 2 і 3, може обмежити синтез жовчних кислот печінковою 7α-гідроксилазою холестерину [25].

Метою цього дослідження було порівняння ефектів орлістату та амідованого альгінату у щурів. Амідовані альгінат та орлістат збільшували втрату жиру у фекаліях; проте спосіб дії обох агентів був різним. Амідований альгінат - це неспецифічний сорбент ліпідів, а орлістат пригнічує гідроліз триацилгліцерину, що є необхідною умовою всмоктування ліпідів. Можна зробити висновок, що обидва агенти збільшували втрату жиру з організму, амідований альгінат, проте ефективніше контролював холестеринемію та рівень холестерину в печінці. На відміну від амідованого альгінату, орлістат не суттєво знижував загальний рівень холестерину в сироватці крові, а його вплив на печінковий холестерин був менш вираженим. Орлістат не суттєво збільшив фекальні виділення холестерину та його метаболіту копростанолу.

Махмуд та Ельнур [26] повідомили, що у щурів, які харчувались жирною дієтою, орлістат у дозі 200 мг/кг значно знижував вміст триацилгліцеринів у сироватці крові, ЛПНЩ та загального холестерину. Інші дослідження, доступні в літературі на щурах, в основному зосереджуються на впливі орлістатів на активність ліпази підшлункової залози, збільшення маси тіла [26], масу жиру в тілі [27], привабливість жиру в харчуванні [28] та лікування некон’югованої гіпербілірубінемії [29]. Дані про вплив орлістату на активність кишкової холестеринової естерази відсутні в літературі. Гідроліз ефірів холестерину необхідний для засвоєння холестерину.

Як амідований альгінат, так і орлістат знижували концентрацію насичених жирних кислот у екскрементах щурів та збільшували концентрацію мононенасичених та поліненасичених жирних кислот. Це може бути пов’язано з тим, що ненасичені ліпіди легше включаються в змішані міцели в кишечнику. У нашому попередньому дослідженні [20] амідований альгінат знижував молярний відсоток насичених жирних кислот у екскретах та збільшував частку мононенасичених жирних кислот.

Активність амінотрансфераз та білірубіну в сироватці крові не зростала у щурів експериментальних груп; таким чином, амідований альгінат та орлістат не мали негативного впливу на здоров’я печінки.