Визначені поживні дієти змінюють сприйнятливість до Clostridium difficile Асоційоване захворювання у мишачої моделі

Порівну сприяв цій роботі разом з: Джон Х. Мур, Кайо К. Д. Пінейро

Афілійований відділ інфекційних хвороб та міжнародної охорони здоров'я, Університет Вірджинії, Шарлоттсвілль, Вірджинія, Сполучені Штати Америки

Порівну сприяв цій роботі разом з: Джон Х. Мур, Кайо К. Д. Пінейро

Афілійований інститут біомедицини, Федеральний університет Сеари, Форталеза, Бразилія

Джон Х. Мур,
Кайо К. Д. Пінейро,
Една І. Заенкер,
Девід Т. Болік,
Глініс Л. Коллінг,
Едвард ван Опстал,
Франсіско Дж. Д. Норонья,
Педро Х. К. С. Де Медейрос,
Рафаель С. Родрігес,
Альдо А. Ліма

Виправлення

15 вересня 2015 року: Мур Дж. Й., Пінейро ПЗЗ, Заенкер Е. І., Болік Д. Т., Коллінг Г. Л. та ін. (2015) Виправлення: Визначені поживні дієти змінюють сприйнятливість до Clostridium difficile Асоційоване захворювання у мишачої моделі. PLOS ONE 10 (9): e0137037. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137037 Виправлення перегляду

Цифри

Анотація

Передумови

Clostridium difficile є основною причиною діареї, асоційованої з антибіотиками, що піддається лікуванню та лікуванню. Поганий харчовий статус сприяє смертності через ослаблені захисні сили хазяїна проти різних патогенів. Основною метою цього дослідження було оцінити внесок дієти зі зниженим вмістом білка у результати зараження C. difficile у мишачої моделі.

Методи

Мишей C57BL/6 годували традиційною домашньою чау-їжею або визначеною дієтою або 20% білка, або 2% білка, і заражали штамом C. difficile VPI10463. У тварин спостерігали за ступенем тяжкості захворювання, випаданням клостридій та вмістом токсинів у фекаліях. Вибрані мікробіоти кишечника вимірювали в калі і ріст C. difficile та вироблення токсину кількісно визначали ex vivo у вмісті кишечника у необроблених або оброблених антибіотиками мишей, яких годували різними дієтами.

Результати

Інфіковані C. difficile миші, яких годували певними дієтами, особливо (і несподівано) з дієтичним дефіцитом, мали виживання, зменшували втрату ваги та загальну тяжкість захворювання. Пролиття C. difficile та токсин у калі в традиційній дієтичній групі було збільшено порівняно з визначеною дієтою через 1 день після зараження. Миші, які харчувались традиційною дієтою, мали підвищене співвідношення твердих речовин кишечника до бактеріоїдетів після впливу антибіотиків у порівнянні з дієтичною дієтою, що визначала 2% або 20%. Інокуляція вмісту сліпої кишки мишей, які отримували антибіотики, ex vivo, знизила вироблення токсину та ріст C. difficile в обох визначених дієтах порівняно з традиційною дієтою.

Висновки

Встановлено, що дієти з низьким вмістом білка та певні поживні речовини в цілому захищають від CDI у мишей. Пов’язані з дієтою зміни мікробіоти кишечника можуть впливати на стійкість до колонізації та вироблення токсину клостридії в певних харчових раціонах порівняно з традиційною дієтою, що призводить до збільшення виживання. Однак механізми, що призвели до різниці виживання між дієтами, що визначаються білками від 2% до 20%, потребують подальшого з'ясування.

Цитування: Moore JH, Pinheiro CCD, Zaenker EI, Bolick DT, Kolling GL, van Opstal E та ін. (2015) Визначені дієти з поживними речовинами змінюють сприйнятливість до хвороби Clostridium difficile у моделі мишей. PLOS ONE 10 (7): e0131829. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0131829

Редактор: Markus M. Heimesaat, Charité, Campus Бенджамін Франклін, НІМЕЧЧИНА

Отримано: 23 березня 2015 р .; Прийнято: 6 червня 2015 р .; Опубліковано: 16 липня 2015 р

Наявність даних: Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.

Фінансування: Фінансування здійснювали NIH/NIAID U01 AI075526 та Фонд Білла та Мелінди Гейтс APP16340. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Clostridium difficile - це анаеробна, спороутворююча, грампозитивна бактерія [1], яка спричинює захворювання головним чином завдяки активності двох токсинів, TcdA та TcdB. Деякі штами C. difficile продукують третій токсин, бінарний токсин (CDT) або трансферазу C. difficile, що може сприяти гіпервірулентності (наприклад, у штаму Nap1/027) [2]. C. difficile також визнаний головним збудником діареї, асоційованої з антибіотиками, і піддається лікуванню [3]. Інфекція C. difficile (CDI) має широкий клінічний діапазон від безсимптомного перенесення до легкої самообмежуючої діареї до важкого псевдомембранозного коліту (ПМК) [4]. З появою гіпервірулентних штамів та збільшенням використання антибіотиків частота CDI різко зросла за останні роки. Дослідження, проведені в Канаді, США та Європі, за останнє десятиліття збільшують у два-чотири рази рівень захворюваності CDI [5, 6].

Вплив антибіотиків є найважливішим фактором ризику розвитку ІХС [7]. До появи антимікробних препаратів ПМК був відносно рідкісним захворюванням, здебільшого пов’язаним із операціями на товстій кишці, тазу або шлунку [4]. Коменсальна мікробіота пригнічує колонізацію та надмірне зростання C. difficile та інших кишкових збудників [8, 9]. Змінений склад мікробіоти кишечника спостерігався у пацієнтів з діареєю, пов’язаною з антибіотиками [10]. Окрім використання антибіотиків, існує ще кілька важливих факторів ризику, пов'язаних з ІРЗ, включаючи: похилий вік [7, 11], часті госпіталізації та тривале перебування в лікарні [12, 13]. Вплив харчового статусу на CDI не досліджували.

Поганий харчовий статус загальновизнаним є широко розповсюдженою проблемою здоров'я, наслідки якої є як гострими, так і часто довготривалими. Недоїдання сприяє смертності, прямо чи опосередковано, через ослаблений захист проти інших захворювань, таких як малярія, респіраторні або діарейні захворювання [14]. Показано, що при деяких кишкових інфекціях, таких як криптоспоридіоз, лямбліоз та ентероагрегативна кишкова паличка, дієта з дефіцитом білка призводить до гірших наслідків від цих захворювань на мишачих моделях кишкової інфекції [15–17].

Дієта змінює мікробіоти кишечника у людини [18]. Конкретні поживні речовини можуть бути пов’язані зі змінами мікробіоти кишечника, які змінюють тяжкість запалення кишечника (наприклад, переростання білофілії вадсвортією через надмірне споживання насичених жирів у мишей-нокаутів IL-10, що призводить до погіршення хронічного коліту [19], який зазвичай зустрічається у цієї моделі тварин), тоді як пробіотики (комбінація Lactobacillus, Bifidobacterium та Streptococcus salivarius) може допомогти полегшити запальну хворобу кишечника у людей [20]. Оскільки дієта змінює мікробіоти кишечника та харчовий статус, включаючи дефіцит білка, впливає на сприйнятливість до інфікування іншими кишковими інфекціями, ми дослідили, як недоїдена білка дієта може змінити тяжкість захворювання на мишачій моделі CDI, і вивчили роль дієти зі зниженим вмістом білка. щодо відібраної коменсальної мікробіоти та тягаря інфекції на мишачій моделі. Дивно, але ми виявили, що білок, який страждає від недоїдання білка, забезпечував захист від смертності від CDI, тоді як традиційна дієта збільшувала смертність у порівнянні з будь-якою з визначених дієтичних дієт, а також пов'язане збільшення навантаження патогенів та змін мікробіоти.

Методи та матеріали

Мишачі дієти

Мишача модель зараження C. difficile

Аналіз токсину A/B

Для визначення навантаження токсину в калі використовували тест C. DIFICICE TOX A/B II (Techlab, Blacksburg, VA), а зразки обробляли відповідно до рекомендацій виробника. Зразки нормалізували відповідно до ваги з використанням розчинника, наданого в наборі. Зразки розбавляли в 10 разів і відліки оптичної щільності (OD) відбирали при 450/620 нм (відліки відбирали при 450 нм, затушували проти повітря при 620 нм).

Кількісні аналізи бактерій

Вивчення впливу дієт на відібрану мікробіоту у мишей

Для вивчення змін мікробіоти з різних дієт та антибіотиків мишей садили на різні дієти (традиційна дієта Харлана (номер за каталогом 7912), дієта Харлану з 2% білком (TD.08679), Харлан з дієтою, що визначає білок з вмістом білка 20% (TD.08678) ) протягом 19 днів. Окремі групи також отримували антибіотики через 14 днів після початку дієт, як це описано в дослідженнях щеплення ex vivo (1B). Через 19 днів мишей евтаназували, а також вміст оболонки товстої і сліпої кишки та тканини збирали для екстракції ДНК та qPCR, як описано в розділі Бактеріальні кількісні аналізи. Зрізи тканин товстої і сліпої кишок промивали сольовим розчином, забуференним фосфатом, щоб видалити залитий вміст перед подальшим аналізом.

Мишача модель колонізаційної стійкості до C. difficile

Ця опублікована модель [28] була модифікована для цього дослідження. Мишам проводили відповідні дієти і попередньо обробляли їх антибіотиками, як описано вище. Після лікування антибіотиками (Рисунок 1B), мишей евтаназували, а вміст сліпої кишки збирали і зберігали при -20 ° C до обробки. В анаеробних умовах вміст сліпої кишки розбавляли втричі у стерильному попередньо відновленому фосфатно-сольовому розчині (PBS), інокулювали 10 4 штам CFU C. difficile штам VPI 10463 та інкубували протягом 24 годин. Рівні клостридії та токсину вимірювали за допомогою ПЛР та ІФА відповідно, як описано вище.

Статистичні методи

Статистичний аналіз проводили за допомогою GraphPad Prism версії 5.0 (програмне забезпечення GraphPad, Сан-Дієго, Каліфорнія). Дані були представлені як середнє значення +/- стандартна помилка середнього значення (SEM). Значущість у всіх випадках була встановлена на рівні p≤0,05. Дані виживання аналізували за допомогою аналізу виживання Log-rank (Mantel-Cox). Бали, ваги та значення аналізу аналізували, використовуючи односторонній, двосторонній або повторний дисперсійний аналіз мір (ANOVA), або двосторонній t-тест студента, де це доречно. Пост-тест на корекцію Бонферроні використовували разом із значними результатами ANOVA, щоб визначити, де значущі відмінності між групами. У бактеріальних кількісних аналізах для досягнення нормального розподілу використовували log 10 значень результатів.

Результати

Дієта з дефіцитом білка або певна дієта захищає від важкої інфекції C. difficile

Миші сиділи на вказаних дієтах, починаючи з 12–14 днів до і через 14 днів після зараження штамом C. difficile VPI 10463.В: Рівень виживання. Тести Log-Rank підтвердили суттєві відмінності між традиційною дієтою та кожною білковою дієтою на 20% та 2% (p Рис. 3. Кількісна оцінка мікробіоти кишечника phyla Firmicutes, Bacteroidetes та Enterobacteriaceae та загальних бактерій за допомогою qPCR.

Вміст кишечника брали у мишей, яких годували або традиційною, визначеною на 20%, або 2% дієтою, як зазначено в Рисунок 1B. Мишей, яких годували зазначеними дієтами, лікували антибіотиками та без них. N = 3 тварини на групу, причому кожну пробу беруть у двох примірниках, а результати нормують до 10 мкг проби. Бактероїдети були значно вищими у вмісті сліпої кишки у мишей, які отримували або 2%, або 20% дієту, порівняно з традиційною дієтою (p Рис. 4. Співвідношення твердих речовин до бактеріоідів.

Співвідношення твердих речовин до бактеріоідів у вмісті товстої кишки (просвіт) було значно вищим (ANOVA p = 0,0021, після тестів обидва p Рис. 5. Інокуляція вмісту сліпої кишки Ex vivo C. difficile.

A. Рівні токсину C. difficile (токсин A/B ELISA) у вмісті сліпої кишки через 24 години після інокуляції 10 4 VPI 10463 (N = 3 для кожної групи). Одноразовий ANOVA з корекцією Бонферроні після тесту не показав суттєвих відмінностей між групами B. Кількісна ПЛР у режимі реального часу гена токсину B C. difficile, tcdB, у інокульованих сліпих клітинах через 24 години після інокуляції (N = 3 для кожної групи, призводить до дубліката). Було помітно вищий ріст C. difficile у традиційному вмісті сліпої кишки з антибіотиками порівняно з 20-процентною дієтичною групою з антибіотиками (р 5 інокулят КУО. A, коефіцієнт виживання. B, клінічний бал. C, зміна ваги. D, гістопатологія Бали.