Виноградне борошно Шардоне покращує стеатоз печінки та резистентність до інсуліну завдяки зміненій експресії печінкового гена для окисного стресу, запалення та синтезу ліпідів та керамідів у мишей із ожирінням, індукованих дієтою

Партнерський коледж ветеринарної медицини, Університет Конкук, Хваян-дун, Кванджін-гу, Сеул, Південна Корея

Філія USDA, ARS, Олбані, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Партнерський коледж ветеринарної медицини, Університет Конкук, Хваян-дун, Кванджін-гу, Сеул, Південна Корея

Афілійований відділ продуктів харчування та харчування, Університет Ханьян, Вангсімні-ро, Сондун-гу, Сеул, Південна Корея

Філія USDA, ARS, Олбані, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Кун-Хо Сео,
Гленн Е. Бартлі,
Крістіна Там,
Хон-Сок Кім,
Дон Хьон Кім,
Юнг-Ван Чон,
Хюнсук Кім,
Уоллес Йокогама

Цифри

Анотація

Цитування: Seo K-H, Bartley GE, Tam C, Kim H-S, Kim D-H, Chon J-W та ін. (2016) Борошно виноградних кісточок Шардоне покращує стеатоз печінки та резистентність до інсуліну за допомогою зміненої експресії печінкового гена для окислювального стресу, запалення та синтезу ліпідів та керамідів у мишей із ожирінням, спричинених дієтою. PLoS ONE 11 (12): e0167680. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0167680

Редактор: Карлос М. Родрігес-Ортігоса, Університет Наварри, ІСПАНІЯ

Отримано: 8 квітня 2015 р .; Прийнято: 18 листопада 2016 р .; Опубліковано: 15 грудня 2016 року

Це стаття з відкритим доступом, вільна від авторських прав, і може бути вільно відтворена, розповсюджена, передана, модифікована, побудована або використана будь-ким в будь-яких законних цілях. Робота доступна під присвятою Creative Commons CC0 у відкритому доступі.

Наявність даних: Усі відповідні дані містяться в документі та супровідному інформаційному файлі.

Фінансування: Ця робота була підтримана грантом Національного дослідницького фонду Кореї (NRF), що фінансується урядом Кореї (MSIP) (No.2015R1A2A2A01005017) та частково грантом І етапу програми досліджень інновацій для малого бізнесу Національного інституту продовольства та сільського господарства (NIFA) ( NIFA/SBIR 2013-00549).

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Безалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) визнана важливою проблемою громадського здоров'я. Поширеність НАЖХП становить 20-30% загального населення західних країн [1]. NAFLD варіюється від стеатозу (проста жирова печінка) до неалкогольного стеатогепатиту (NASH), стану, що збільшує печінкову захворюваність та смертність. Надмірне накопичення ліпідів у печінці, стрес, окислювальний та ендоплазматичний ретикулум (ER), запалення та резистентність до інсуліну є основними проявами прогресування цього захворювання. Хоча етіологія НАЖХП не до кінця зрозуміла, «гіпотеза про два удари» є загальновизнаною [2]. У цій гіпотезі надмірне накопичення печінкових ліпідів супроводжується посиленням окисного стресу та запалення, що призводить до пошкодження печінки.

Більшість досліджень щодо сприятливого впливу виноградних кісточок на НАЖХП проводились із використанням водних або спиртових поліфенольних екстрактів виноградних кісточок [14–17]. Останнім часом увага до користі для здоров’я флавоноїдів у виноградних продуктах розширилася на виноградні кісточки винограду, побічний продукт процесу виноробства. Цілі кісточки винограду можуть містити значну кількість невитяжних фенольних сполук, що сприяють їх біологічній активності. Виноградні кісточки містять дві третини витяжних флавоноїдів винограду і мають найвищі концентрації найпоширеніших флавоноїдів, флаван-3-олів (флаванолів). Флаваноли включають катехін, епікатехін, їх 3-О-галати та (епі) катехінові димери, олігомери та полімери. Мономерний (епі) катехін легко всмоктується тонкою кишкою. Олігомери та полімери не всмоктуються, але їх метаболіти фенольної кислоти, що виробляються кишковими бактеріями, поглинаються.

Матеріали і методи

Тварини та дієти

Колекція плазми та печінки

Мишей позбавляли корму протягом 12 год і знеболювали випарником (VetEquip, Лівермор, Каліфорнія) 4% ізофлураном (Phoenix Pharmaceutical, Сент-Джозеф, Міссурі, США) та витратою кисню 1 л/хв в індукційній камері. У лежачих тварин підтримували 2–4% ізофлурану через носовий конус, а кров відбирали шляхом серцевої пункції шприцами, попередньо промитими розчином калію ЕДТА (15% мас./Об.). Пізніше печінку та жирові тканини епідидиму збирали, зважували та негайно заморожували у рідкому азоті для подальшого аналізу. Плазму відокремлювали після центрифугування при 2000 × g протягом 30 хв при 4 ° C.

Загальний вміст ліпідів у печінці

Після сублімаційного висихання порошкоподібні печінки зважували і змішували з 2 мл CHCl3/MeOH (2: 1), обробляли ультразвуком протягом 5 хв і інкубували протягом ночі. Зразки центрифугували протягом 10 хв при 1000 об/хв і супернатанти видаляли. Ще 2 мл CHCl3/MeOH додавали перед обробкою ультразвуком і витримували всю ніч для екстракції. З комбінованих екстрактів під азотом видаляли розчинник, а загальний вміст ліпідів у печінці визначали гравіметрично.

Видобутий вміст флавоноїдів

Зразок 0,2 г екстрагували 20 мл метанолу протягом 30 хв з струшуванням з подальшим обробкою ультразвуком та центрифугуванням. Супернатанти піддавали високоефективній рідинній хроматографії (ВЕРХ) та загальному фенольному аналізу. Загальний вміст фенолів та флавоноїдних сполук аналізували за допомогою Фолін-Ціокальтеу та стандартних методів ВЕРХ відповідно, як описано раніше [20].

Аналіз ліпідів у плазмі крові

Холестерин ліпопротеїдів у плазмі крові визначали методом ексклюзивної хроматографії, як описано раніше [21]. ВЕРХ проводили з використанням хроматографа ВЕРХ Agilent 1100 з колоною ВЕРХ Superose 6HR (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ, USA), що складається із змішувальної котушки (1615–50 Бодман, Астон, Пенсільванія, США) у воді з контрольованою температурою. куртка (Aura Industrials, Staten, NY, США). Насос ВЕРХ Hewlett-Packard (79851-A; Agilent Technologies, Пало-Альто, Каліфорнія, США) був використаний для доставки холестеринового реагенту (Roche Diagnostics, штат Індіанаполіс, США, США) зі швидкістю потоку 0,2 мл/хв. Для калібрування сигналів на основі пікових площ використовували стандарти ліпопротеїну бичачого холестерину.

Тест на толерантність до інсуліну та тест на толерантність до глюкози

Для тесту на толерантність до інсуліну (ІТТ) після 3-годинного голодування мишам вводили інсулін внутрішньочеревно (0,5 ОД/кг маси тіла), а рівні глюкози в крові хворої вени визначали через 0, 30 та 60 хв після ін’єкції інсуліну Ультраметр OneTouch (LifeScan Inc. Wayne, PA, США). Тест на толерантність до глюкози (ГТТ) проводили після внутрішньочеревного введення глюкози (2 г/кг маси тіла). Концентрацію глюкози в крові визначали зразками крові в хвостовій вені через 0, 15, 30, 60 та 120 хв після ін'єкції глюкози за допомогою ультраметра OneTouch (LifeScan, Inc.).

Експресія генів та аналіз мікрочипів Exon

ПЛР у режимі реального часу

Загальну РНК з печінки витягували за допомогою набору для очищення РНК TRIzolplus (Invitrogen, Life Technologies), а кДНК синтезували за допомогою набору GeneAmpRNA PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) відповідно до протоколу виробника. По одному мікролітру розведеної кДНК (1:10) використовували в кожному реальному часі (RT) -PCR, використовуючи SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Геркулес, Каліфорнія, США) з інструментом Mx3000P (Stratagene, Cedar Creek, TX, USA ). Умови циклу були такими: 5 хв при 95 ° C, а потім 40 циклів при 94 ° C протягом 15 с, 55–60 ° C протягом 1 хв і 72 ° C протягом 30 с. Послідовності праймерів наведені в Таблиці 2 та в наших [22,23] та інших попередніх дослідженнях [24]. Праймери перевіряли за розмірами продукту ПЛР. Під час гель-електрофорезу продуктів ПЛР не спостерігалося накопичення неспецифічних продуктів або димерів праймерів. Результати аналізували за допомогою програмного забезпечення, що постачається із системою Stratagene Mx3000P QPCR. Відмінності в експресії мРНК розраховували після нормалізації до експресії мРНК 36B4, використовуючи метод ΔΔCT.

Печінковий рівень АФК

Рівень АФК у печінці визначали за допомогою флуоресцентного зонда дихлорфлуоресцеїну (DCF), як описано раніше [25]. Вихідний розчин 2 ’, 7’-дихлорфлуоресцину діацетату (DCFDA, D6883, Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) готували шляхом розчинення DCFDA в 12,5 мМ етанолу і зберігали при -80 ° C до використання. Приблизно 20 мг печінки гомогенізували в 0,5 мл сольового розчину, забуференного HEPES (140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкози), центрифугували при 1000 × g протягом 10 хв. Гомогенат, що містить 100 мкг білка, піпетували в чорну 96-лункову платівку. DCFDA розбавляли до 125 мкМ безпосередньо перед використанням і піпетували в кожну лунку до кінцевої концентрації 25 мкМ. Платівку поміщали на шейкер на 2 хв і інкубували при 37 ° С у темряві протягом 30 хв. Флуоресценцію зчитували на лічильнику Wallac Victor 3 Multilabel (PerkinElmer Inc., Waltham, MA) при збудженні 485 нм/випромінювання 530 нм через 0 і 50 хв. Рівень АФК виражався як збільшене значення поглинання від 0 до 50 хв. Середнє значення інтенсивності флуоресценції розраховували з п'яти мишей на групу.

Вестерн-блот-аналіз

Статистичний аналіз

Усі дані виражаються як середнє значення ± SE. Дисперсійний аналіз проводили за допомогою статистичної програми JMP7 (SAS Institute, Cary, NC, USA) для вивчення ефектів лікування на рівень ліпідів у плазмі крові, вагу тіла та тканин, загальне споживання енергії та коефіцієнт корисної дії. Значимість була визначена в таблиці P 3. Вага тіла та жирової тканини та споживання енергії у мишей DIO, яких годували MCC та ChrSd протягом 5 тижнів 1 .

Дані виражаються як середнє значення ± SE; n = 8–10/група. * P Рис. 2. Вплив борошна з виноградних кісточок Шардоне (ChrSd) на (А) ліпіди в плазмі та (В) лептин.

Самців, що страждають ожирінням від самців (DIO), протягом 5 тижнів годували дієтами з високим вмістом жиру (HF), що містять 5% мікрокристалічної целюлози (MCC, контроль) або 10% (w/w) ChrSd, а кров збирали у дефіцитному харчуванні держава. ЛПНЩ, ліпопротеїни дуже низької щільності; ЛПНЩ, ліпопротеїди низької щільності; ЛПВЩ, ліпопротеїни високої щільності. Дані виражаються як середнє значення ± SE; n = 8–10/група. * P Рис. 3. Толерантність до інсуліну у мишей із ожирінням, яких годували високожирною (ВЧ) дієтою, доповненою 5% мікрокристалічною целюлозою (MCC, контроль) або 10% (мас./Мас.) Виноградного борошна з насіння Шардоне (ChrSd) протягом 5 тижнів.

(А) Тести на толерантність до інсуліну (ІТТ) проводили у стані голодування. (B) Значення площі під кривою (AUC). Дані виражаються як середнє значення ± SE. n = 8–9/група. * P Таблиця 4. Короткий зміст відібраних генів, що демонструють значну ≥ | 1,5 | -кратну модуляцію печінки у мишей, які отримували ВЧ-дієту, доповнену ChrSd.

Для підтвердження спостережень за мікрочипами було вибрано 13 генів, пов’язаних з метаболізмом холестерину, β-окисленням жирних кислот, гомеостазом глюкози, імунною системою, окислювальним стресом та метаболізмом тригліцеридів для перевірки методом RT-PCR. Усі гени демонстрували закономірності експресії, порівнянні з даними мікрочипів (таблиця 5). Для перевірки результатів мікрочипів на рівні білка ми визначили експресію Chi3l1, Sptlc3 та Aldh1a1, спостерігаючи зменшення в 3,1 рази для Chi3l1, 1,6 рази для Sptlc3 та 2,7 рази для Aldh1a1 у мишей DIO, що годували ChrSd, порівняно з мишами на контрольній дієті (рис. 4А та 4В). Постійне зменшення спостерігалось для всіх білків у порівнянні з даними мікрочипів (рис. 4). Інтенсивність флуоресценції DCF, показник внутрішньоклітинного рівня АФК, у печінці мишей DIO, яких годували ChrSd, суттєво зменшилась на 35% порівняно з печінкою мишей DIO, яких годували контрольною дієтою (рис. 4C).

(A) Вестерн-блотинг Chi3l1, Sptlc3 та Aldh1a1 у білкових екстрактах печінки самців мишей із ожирінням, викликаних дієтою (DIO), що харчуються дієтами з високим вмістом жиру (HF), що містять 5% мікрокристалічної целюлози (MCC, контроль) або 10% ( w/w) ChrSd протягом 5 тижнів. (B) Кількісна оцінка експресії білка в (A). (C) Інтенсивність флуоресценції DCF у печінці самців мишей DIO, яких годували ВЧ дієтами, що містять 5% MCC або 10% ChrSd протягом 5 тижнів. Дані виражаються як середнє значення ± SE; n = 3/група. * P | 2,0 | у присутності добавки ChrSd (дані не наведені). Подальший аналіз з використанням RT-PCR необхідний для підтвердження альтернативного сплайсингу цих генів.

Обговорення

Багатий катехінами екстракт виноградних кісточок доповнює регульовану експресію генів, пов’язаних з окисленням жирних кислот у печінці мишей [8]. Ми також виявили, що багата катехінами дієта ChrSd знижувала регулювання генів, пов'язаних із синтезом жирних кислот (Scd1, Acot11, Mogat1), одночасно підвищуючи регуляцію генів, пов'язаних з β-окисленням жирних кислот (Acsl3), порівняно з контрольною дієтою. Як результат, дієта ChrSd знизила вміст ліпідів у печінці, сприяючи потенційному благотворному впливу на стеатоз печінки. Ми зазначаємо, що наше дослідження не визначало активності ферментів, що беруть участь у окисленні та синтезі жирних кислот. Зміни мРНК не завжди вимірюють потік шляху; однак попередні дослідження показали лінійну залежність між активністю окиснення/синтезу жирних кислот та експресією генів, пов'язаною з метаболічними шляхами жирних кислот. Наприклад, чайні катехіни підвищують активність мРНК Acox1 та жирних кислот у печінці [44].

Кілька досліджень припустили, що оксидативний стрес є важливим у розвитку ускладнень, пов’язаних із ожирінням, таких як резистентність до інсуліну та діабет 2 типу [38]. Споживання екстракту червоного винограду покращило індукований фруктозою ER-стрес та чутливість до інсуліну у здорових родичів першої ступені із надмірною вагою пацієнтів із діабетом 2 типу [13]. Наше дослідження показало, що добавки багатого флавоноїдами ChrSd суттєво знижують експресію гена, що реагує на печінковий стрес, Gdf15 та покращує чутливість до інсуліну, як показано 26% зниженням AUC протягом 2-годинного ІТТ порівняно з контролем. Добавки ChrSd також суттєво знижували концентрацію глюкози натощак і AUC протягом 2-годинного GTT (контрольна AUC, 55,113 ± 2431; AUC ChrSd, 44,735 ± 2509, P Рис. 5. Запропоновані механізми, за допомогою яких збагачене флавоноїдами борошно з виноградних кісточок Шардоне (ChrSd) покращує індукована інсуліном резистентність до жиру (СН), стеатоз печінки та неалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП).

Добавки з ChrSd знижують HF-індуковану резистентність до інсуліну та стеатоз печінки та посилюють чутливість до лептину, що супроводжується зниженням окисного стресу та запалення через зменшення АФК та синтезу кераміду. Результатом є можливе покращення прогресування НАФЛД, спричиненого СН. АФК, активні форми кисню.

Довідкова інформація

S1 Таблиця. 10 найкращих біологічних функцій та 5 найкращих канонічних та мережевих шляхів генів, суттєво модульованих ChrSd.

Подяка

Ця робота була підтримана грантом Національного дослідницького фонду Кореї (NRF), що фінансується урядом Кореї (MSIP) (No.2015R1A2A2A01005017) та частково грантом І етапу програми досліджень інновацій для малого бізнесу Національного інституту продовольства та сільського господарства (NIFA) ( NIFA/SBIR 2013–00549). Велика подяка Sonomaceuticals, LLC/WholeVine Products та їхній сестринській компанії за внесок виноградних борошнів та аналіз складу, а також пані Крістіні Там за її чудову технічну допомогу з вестерн-ляпками.

Внески автора

Концептуалізація: KHS HK WY.
Курація даних: GEB CT HK WY.
Формальний аналіз: GEB CT HSK DHK JWC HK WY.
Придбання фінансування: HK WY.
Розслідування: KHS HK WY.
Методологія: GEB CT HK WY HSK DHK JWC HK WY.
Адміністрація проекту: KHS HK WY.
Ресурси: HK WY.
Нагляд: HK WY.
Написання - оригінальний проект: HK.
Написання - огляд та редагування: KHS HSK DHK JWC HK WY.