Погляньте на останні статті

Тривале споживання дієти з високим вмістом жиру погіршує рухову координацію, не впливаючи на загальну рухову активність

Клініка Майо, відділення неврології, 200 First St. SW, Рочестер, MN 55905, США.

Клаудіо А Мастронарді

Школа медицини та медичних наук, Університет дель Росаріо, Богота, Колумбія.

Дослідницька група з неврології (NEUROS), Університет дель Росаріо, Богота, Колумбія.

Медичний коледж, Державний університет штату Нью-Йорк, штат Медичний університет штату штат Нью-Йорк, Сіракузи, Нью-Йорк, США.

Кафедра психіатрії, Державний університет Нью-Йоркського медичного університету штату Нью-Йорк, Сіракузи, Нью-Йорк, США.

Тема розуму та мозку, Південно-Австралійський інститут охорони здоров’я та медичних досліджень, Аделаїда, Австралія .

Кафедра психіатрії Медичного коледжу університету Фліндерса, Бедфорд-Парк, Австралія.

Анотація

Ключові слова

рухова координація, високий вміст жиру, дофамінергічний нейрон, мікроглія, діабет

Скорочення:

АВС: авидин-біотиновий комплекс; AEEC: Комітет з етики експериментів з тваринами Австралійського національного університету; ЦНС: центральна нервова система; DA: дофамін; DAB: 3,3`-діамінобензидин; GTT: внутрішньочеревний тест на толерантність до глюкози; i.p .: внутрішньочеревно; ІЛ-1: інтерлейкін-1; IL-1R1: рецептор IL-1 1; IL-1ra -/-: нокаутування антагоніста рецептора IL-1; IL-1Гџ: IL-1 бета; ІЛ-1О ±: ІЛ-1 альфа; LPS: ліпополісахарид; PBS: сольовий розчин, забуференний фосфатом; PD: хвороба Паркінсона; об/хв: обертів в хвилину; SEM: стандартна похибка середнього значення; СН: чорна субстанція; SNpc: substantia nigra pars compacta; SNpr: substantia nigra pars reticulata; TH: тирозингідроксилаза; VTA: вентральна тегментальна область; WT: дикий тип

Вступ

Матеріали і методи

Тварини

Шеститижневих самців мишей C57bl/6 (10 на експериментальну групу) утримували у групах до п'яти особин в клітці та утримували їх у стандартних умовах життя (22 +/- 2ºC, 12/12 годинний цикл світла/темряви, їжа та вода ad libitum). Ці умови залишались незмінними протягом усього експерименту, якщо не вказано інше. Мишей годували або HFD, або RD протягом 15 місяців. Усі експерименти на тваринах проводились згідно з правилами та правилами «Австралійського кодексу практики догляду та використання тварин у наукових цілях». Всі експериментальні протоколи були схвалені Комітетом з етики експериментів на тваринах Австралійського національного університету (AEEC).

Годування

Шеститижневим мишам-самцям було дозволено вільний доступ до будь-якої HFD (18,6% жирності та 44,3% вуглеводів, що постачаються з Speciality Feed (Австралія, номер кота: SF10-020); ця дієта еквівалентна дієті Харлана Теклада, номер кота: TD.95217) або RD (4,8% жирності та 59,4% вуглеводів, що постачаються зі спеціальних кормів (Австралія, номер коту: SF10-020).

Тести поведінки

Тести поведінки проводили з 8 тижневого віку (два рази на місяць) і до 12 місяців.

Тест на відкритому грунті: Навички руху, координації та рівноваги оцінювали, коли миші були молодими (віком 42-45 днів) і через 9 місяців (тобто коли їм стало більше 10 місяців). Переміщення визначали, розміщуючи кожну окрему мишу на відкритій арені (48 см х 48 см) і реєструючи її активність протягом 32 хвилин за допомогою відеокамери, розміщеної зверху на арені. Для збору та обробки даних використовувалося програмне забезпечення “Viewer 3” (Biobserve Gmbh, Санкт-Августин, Німеччина), яке забезпечувало вимірювання загальної пройденої відстані.

Тест сітки (тест на звисання чотирьох кінцівок): Тест сітки використовується для оцінки сили кінцівок миші [22, 23]. Цей тест був використаний як контрольний тест, щоб визначити, чи можуть спостерігатися відмінності в руховій координації, що виявляються різними мишами в тесті на ротарод, через зменшення сили м'язів. Тест спрямований на визначення здатності тварини захоплювати дротяну сітку як передніми, так і задніми кінцівками і залишатися чіплятими в перевернутих положеннях протягом певного періоду часу. Затримку падіння реєстрували за секунди та аналізували. Мишам давали три випробування, розділені міжплемінними інтервалами у 5 хвилин. Висота апарату становить 20-50 см, щоб тварина не могла легко зійти вниз.

Полюсний тест: Цей тест представляє один із можливих методів, що застосовуються для оцінки спритності тварин. В основному використовується як вимірювання брадикінезії (повільності руху) [24]. Тест вимагає використання жердини висотою від 50 до 55 см і діаметром від 8 до 10 мм з шорсткою поверхнею, яка вертикально стоїть у домашній клітці. Тест проводився шляхом розміщення тварини близько до вершини жердини і залишення голови тварини вгору. Було записано період часу, який тварина витратила на обертання (перше вимірювання) та сходження (друге вимірювання) на стовп. Тому обидва параметри (час на обертання та спуск вниз) використовували для оцінки брадикінезії у мишей.

Кроковий тест: Кроковий тест - ще один надійний метод оцінки акінезії передньої кінцівки [25]. Її виконують на столі, а тварину розміщують на одному його краю. Потім задні ноги піднімають, підтягуючи хвіст тварини вгору, і в такому положенні тварина відтягується назад, до іншого краю столу довжиною 1 метр. Підраховується кількість кроків коригування тварини від обох передніх лап [25].

Тест на зчеплення задніх кінцівок: Цей тест використовується для оцінки дискінезії (зменшення довільних рухів) у мишей [26]. Мишей підвішують у повітрі за хвіст на десять секунд. Положення задніх кінцівок спостерігається і оцінюється. На основі положення кінцівок мишей оцінюють як:

0 - задні кінцівки розводяться назовні,

1- одна задня кінцівка втягнута до живота,

2- обидві задні кінцівки частково втягнуті до живота і

3-задні кінцівки повністю втягнуті і стосуються живота [27].

Метаболічні тести

Вживання їжі та вимірювання маси тіла: Споживання їжі контролювали раз на тиждень, протягом семи місяців. Наприкінці кожних семи днів залишки їжі з клітки зважували та реєстрували. Споживання їжі виражали як середню масу їжі (у ккал) на одну тварину та нормували за масою тіла тварини (BW). Вагу тіла миші вимірювали щотижня протягом тринадцяти місяців. Мишей зважували і реєстрували масу їх тіла. Остаточні результати виражали як середнє значення загальної кількості тварин/на групу. До кінця експериментів in vivo склад тіла (відсоток жирової маси та вага нежирної маси) визначали за допомогою сканування DEXA.

Сканування DEXA: Двоемісійна рентгенівська абсорбціометрія (DEXA) використовується в основному для оцінки мінеральної щільності кісткової тканини (МЩКТ), складу тіла та вмісту жиру [28]. Перед тестуванням тварини глибоко знеболюють 2-3% ізофлуоран-кисневим газом протягом усього періоду випробування (5-10 хвилин), а потім поміщають в апарат PIXImus (мишачий денситометр PIXImus). Все тіло кожної миші сканували та аналізували за допомогою програмного забезпечення PIXImus (LUNAR PIXImus 2). Голова миші була виключена зі сканування за допомогою ROI (область інтересу), яку розміщували вручну, оточуючи все тіло. Для подальшого аналізу використовувались дані: вага та відсоток жирової маси, вага нежирної тканини.

Внутрішньочеревинний тест на толерантність до глюкози (IPGTT): Тест IPGTT використовується для оцінки того, як швидко виводиться глюкоза з крові при введенні глюкози (i.p.). Перед тестуванням мишей переводили в чисті клітки і голодували протягом 6 годин, але їм забезпечували воду за бажанням. Мишей зважували і перевіряли їх початковий рівень глюкози в крові, збираючи одну маленьку краплю крові з хвостової вени тварини через 0 хвилин (вихідна лінія). Потім мишам вводили розчин D-глюкози (2 г/кг, i.p.) [29], який попередньо розчиняли у забуференному фосфатом сольовому розчині (PBS). Рівні глюкози вимірювали глюкометром (Accu Chek®, Рош, Австралія) через 30, 60, 90 та 120 хвилин після ін’єкції. Наприкінці 14 місяців мишачого віку мишей піддавали внутрішньочеревному тесту на толерантність до глюкози, щоб оцінити толерантність до глюкози відповідно до їх лікування. Через два місяці мишей евтаназували, збирали кров, а рівні лептину та інсуліну в плазмі оцінювали методом ІФА.

Імуноферментний аналіз (ІФА): Кров збирали транскардіально в пробірках, покритих етилендіамінтетраоцтовою кислотою (ЕДТА). Зразки крові центрифугували при 2000g протягом 15 хвилин при 4 o C, а плазму відокремлювали від тканини крові і зберігали при -20 o C до використання. Зразки для вимірювання інсуліну розводили у співвідношенні 1/8 для мишей, що годували HFD, тоді як зразки RD не розводили. Інсулін у плазмі крові вимірювали за допомогою набору ALPCO ELISA (миша ультрачутливий інсулін ELISA, номер за каталогом: 80-INSMSU-E01, E10). Рівні лептину вимірювали за допомогою набору мишей Leptin ELISA (DuoSet R&D Systems, номер за каталогом: DY498). Зразки для вимірювання лептину розводили у співвідношенні 1/3 для мишей, що годували RD, і 1/8 для мишей, що годували HFD.

Розтин жирової тканини: Коричневу жирову тканину виділили з дорсального боку грудної клітки між лопатками та зібрали в трубки епендорфа, попередньо зважені, і вимірювали вагу після заморожування в сухому льоду. Епідидимальну, заочеревинну, вісцеральну та коричневу жирові прокладки вручну ізолювали та зважували.

Імуногістохімія нейронів дофаміну та клітин мікроглії

Підготовка тканин: Через 15 місяців після початку експериментів мишам знеболювали внутрішньоочеревинною ін'єкцією кетаміну/ксилазину (100/10 мг на кг, з регулюванням до обсягу 0,1 мл/10 г маси тіла) і транкардіально перфузували розчином холоду фосфатно-сольовий сольовий розчин (PBS) та гепарин (5 Од/мл) протягом 3 хвилин. Мозок миші видаляли і заморожували в охолодженому ізопентанолі і зберігали при -80 ° C до використання. Мозок розрізали за допомогою кріостата (встановленого на -12 ° C) у корональних зрізах 15 мкм по всій СН.

Кількісна оцінка нейронів дофаміну та мікроглії: Для оцінки втрати дофамінових нейронів та кількості активованих клітин мікроглії було зібрано дві сусідні серії з 8 послідовних предметних стекол (товщина 15 мкм) для відбору області SN (ростральна до каудальної: від -2,65 до -3,61 мм ззаду до брегми) [21]. Таким чином, дві серії з восьми рівномірно розташованих предметних стекол отримували кожні 90 мкм і використовували для підрахунку нейронів дофаміну або активованих клітин мікроглії. Межі СН були визначені для того, щоб виключити вентральну тегментальну область (VTA) з підрахунку [32]. Площа, визначена для підрахунку, охоплювала всю територію від ростральної частини SNpc до каудального кінця SN pars reticulata (SNpr), за винятком тих нейронів TH, які пронизані коренем окорухового нерва. Зображення отримували за допомогою цифрової камери IX2-UCB Olympus (Olympus, Токіо, Японія) та аналізували вручну за допомогою програмного забезпечення ImageJ (http://imagej.nih.gov від NIH). Позитивні клітини мікроглії CD68 у SN підраховували вручну на мікроскопі Nikon Eclipse 50i (Nikon, Токіо, Японія). Збільшення зображення становили 20x та 40x для мікроглії та 20x для THG.

Статистичний аналіз

Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення Graph-Pad версії 5 (GraphPad Software, La Jolla California USA) і виражали як Середнє ± стандартна помилка середнього значення (S.E.M). Залежні від часу різниці у поведінкових та метаболічних результатах аналізували неспареним Т-критерієм Стьюдента та двостороннім ANOVA. Значення Р Редакційна інформація

Головний редактор

Террі Ліхтор
Цуйосі Хірата
Шинья Мізуно
Джакомо Коррадо