Штучний підсолоджувач ацесульфам калію впливає на мікробіом кишечника та збільшення маси тіла у мишей CD-1

Афілійований відділ науки про охорону навколишнього середовища, Університет Джорджії, Афіни, Джорджія, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ екологічних наук та техніки, Університет Північної Кароліни в Чапел-Гілл, Чапел-Гілл, Північна Кароліна, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ охорони здоров'я населення та патобіології, Університет штату Північна Кароліна, Ролі, Північна Кароліна, Сполучені Штати Америки

Сяомін Бянь,
Лян Чі,
Бей Гао,
Пенгченг Ту,
Hongyu Ru,
Кун Лу

Цифри

Анотація

Цитування: Bian X, Chi L, Gao B, Tu P, Ru H, Lu K (2017) Штучний підсолоджувач ацесульфам калію впливає на мікробіом кишечника та збільшення маси тіла у мишей CD-1. PLoS ONE 12 (6): e0178426. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0178426

Редактор: Міхай Коваса, Західний університет наук про здоров'я, США

Отримано: 5 січня 2017 р .; Прийнято: 12 травня 2017 р .; Опубліковано: 8 червня 2017 р

Наявність даних: Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.

Фінансування: Університет штату Джорджія, Університет Північної Кароліни та NIH/NIEHS (R01ES024950) надали часткову фінансову підтримку цій роботі.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Як широко використовувані харчові добавки та замінники цукру, штучні підсолоджувачі можуть покращувати смак і одночасно зменшувати споживання калорій. Деякі епідеміологічні дослідження показали, що штучні підсолоджувачі корисні для схуднення та для тих, хто страждає від непереносимості глюкози та цукрового діабету 2 типу [1]. Однак накопичені дані за останні роки свідчать про те, що споживання штучних підсолоджувачів може порушити метаболізм людини, особливо регулювання глюкози [2, 3]. Встановлено, що штучні підсолоджувачі викликають непереносимість глюкози та індукують метаболічний синдром, а також пов’язані з вищим збільшенням маси тіла [3–6]. Ці дані свідчать про те, що штучні підсолоджувачі можуть збільшити ризик ожиріння. Однак конкретний механізм, за допомогою якого штучні підсолоджувачі регулюють метаболізм господаря, залишається невловимим.

У цьому дослідженні ми досліджували вплив Ace-K на мікробіом кишечника та зміни метаболома калу за допомогою секвенування 16S рРНК та метаболоміки газової хроматографії та мас-спектрометрії (GC-MS). Ми виявили, що споживання Ace-K порушило мікробіом кишечника мишей CD-1 після 4-тижневого лікування. Спостережуваний приріст маси тіла, зміни у складі бактеріального співтовариства кишечника, збагачення функціональних генів бактерій та метаболічні зміни фекалій сильно залежали від статі. Зокрема, Ace-K збільшив збільшення маси тіла у мишей самців, але не жінок. Функціональні гени, що беруть участь в енергетичному обміні, активувались у самців мишей, але інгібувались у самок мишей. Більше того, різницю в метаболічних профілях калу спостерігали між самцями та самками. У сукупності ці результати можуть дати нові уявлення про розуміння функціональної взаємодії між штучними підсолоджувачами та мікробіомом кишечника та ролі цієї взаємодії у розвитку ожиріння та хронічного запалення.

Матеріали і методи

Тварини та вплив

7 тижнів) були придбані у річки Чарльз та забезпечені стандартною дієтою для гризунів та водопровідною водою ad libitum за таких умов навколишнього середовища: 22 ° C, вологість 40–70% та світловий світло: темний цикл 12:12 годин. Усі 20 мишей (10 самців і 10 самок) були розміщені в приміщенні для тварин в Університеті Джорджії протягом 1 тижня до експериментів. Потім мишей випадковим чином розподіляли до контрольної та групи Ace-K (по п’ять мишей-самців та п’ять самок у кожній групі). Воду (контроль) та штучні підсолоджувачі вводили мишам (

8 тижнів) через датчик протягом 4 тижнів із дозою 37,5 мг/кг маси тіла/добу. Ця доза була еквівалентна або набагато нижча, ніж ті, що використовувались у попередніх дослідженнях на тваринах [20, 30]. Вагу тіла вимірювали до і після лікування. Статистичної різниці в початковій масі тіла між контрольною групою та групою Ace-K не спостерігалося ні для самців, ні для самок мишей (самці: 26,8 ± 1,1 г та 26,4 ± 1,1 г для контрольної та групи Ace-K; самки: 22,8 ± 1,6 г та 22,4 ± 1,1 г для контрольної та групи Ace-K). Підготовленим персоналом мишей евтаназували CO2 у відповідній камері. Усі експерименти були схвалені інституційним комітетом з догляду та використання тварин Університету Джорджії. З тваринами поводились по-людськи та з огляду на полегшення страждань.

Секвенування генів 16S рРНК

ДНК виділяли із заморожених калових гранул, зібраних у різні моменти часу, за допомогою набору для ізоляції ДНК PowerSoil (Mo Bio Laboratories) відповідно до вказівок виробника, а отриману ДНК кількісно визначали та зберігали при -80 ° C для подальшого аналізу. Очищену ДНК (1 нг) використовували для ампліфікації області V4 16S-рРНК бактерій за допомогою універсальних праймерів 515 (5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) та 806 (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT). Окремі зразки штрих-кодували, об'єднували для побудови бібліотеки секвенування, а потім секвенували Illumina MiSeq в Грузинському геномічному об'єкті, щоб генерувати парні кінці 250 × 250 (PE250, комплект v2) на глибину щонайменше 25000 зчитувань на зразок. Файли FASTQ, пов’язані між собою, були об’єднані та відфільтровані за допомогою Geneious 8.0.5 (Biomatters, Окленд, Нова Зеландія) з обмеженням імовірності помилок 0,01. Потім дані аналізували, використовуючи кількісне уявлення про екологію мікроорганізмів (QIIME, версія 1.9.1). UCLUST був використаний для отримання оперативних таксономічних одиниць (OTU) з 97% подібністю послідовності. Дані були розподілені на п’яти різних рівнях: тип, клас, порядок, сім’я та рід.

Функціональний аналіз збагачення генів

Філогенетичне дослідження спільнот шляхом реконструкції неспостережуваних станів (PICRUSt) (Galaxy Версія 1.0.0) вперше було використано для аналізу збагачення функціональних генів у мікробіомі кишечника кожної групи [31]. PICRUSt може точно профілювати функціональні гени бактеріальних спільнот на основі маркерних генів за даними секвенування 16S та базою даних референтних геномів [32–34]. PICRUSt широко застосовується в аналізі збагачення функціональних генів мікробіомів, с

Повідомляється про точність 95% щодо бактеріальних метагеном [32–34]. Потім результати PICRUSt були імпортовані в пакет статистичного аналізу метагеномних профілів (STAMP) (версія 2.1.3) для подальшого статистичного аналізу та візуалізації [35].

Аналіз метаболоміки

Метаболіти витягували із зразків калу з використанням метанолу та хлороформу, як описано раніше [16]. Коротко кажучи, 20 мг калу перемішували 1 мл розчину метанол/хлороформ/вода (2: 2: 1) протягом 1 години з наступним центрифугуванням при 3200 х г протягом 15 хвилин. Отриману верхню та нижню фази переносили у флакон з газовою хроматографією (GC), сушили приблизно 4 години в SpeedVac і дериватизували, використовуючи N, O-Bis (триметилсилил) трифторацетамід (BSTFA). Система Agilent 6890/5973 GC-MS, оснащена колонкою DB-5ms (Agilent, Санта-Клара, Каліфорнія), була використана для проведення метаболомічного профілювання та захоплення всіх виявлених особливостей метаболіту в діапазоні мас від 50 до 600 м/з. Інтернет-інструмент XCMS був використаний для виявлення та вирівнювання піків та обчислення накопиченої пікової інтенсивності.

Статистичний аналіз

Різницю в окремій мікробіоті кишечника між днем 0 та 4 тижні оцінювали за допомогою програмного забезпечення mothur [36]. Теплова карта була використана для візуалізації кластеризації збагачених функціональних генів. Двохвостий t-тест Уелча (p Рис. 1. Вплив споживання Ace-K за чотири тижні на збільшення маси тіла та склад мікробіомів кишок мишей CD-1.

(А) Приріст маси тіла мишей-самців, які отримували Ace-K, був значно вищим, ніж у контрольних мишей-самців, тоді як приріст маси тіла самок мишей суттєво не відрізнявся від збільшення у контрольних. (B) Споживання Ace-K змінило склад кишкових бактерій у самок мишей. Рясність Lactobacillus, Clostridium, невідведеного роду Ruminococcaceae та невідведеного роду Oxalobacteraceae значно зменшилися, а кількість Mucispirillum збільшилася після споживання Ace-K. (C) Споживання Ace-K змінило склад кишкових бактерій у мишей-самців. Рівень бактероїдів, анаеростипедів та саттерел значно збільшився після споживання Ace-K (* р 0,05).

2. Ace-K змінив компоненти мікробіому кишечника в залежності від статі

Враховуючи, що Ace-K викликав гендерно-залежний приріст маси тіла у тварин і враховуючи вирішальну роль кишкових бактерій в енергетичному гомеостазі господаря, ми далі досліджували, чи Ace-K по-різному впливає на мікробіоти кишечника мишей самців та жінок. Фіг. 1B і 1C демонструють суттєво змінені роди кишкових бактерій (p Рис. 2. Аналіз функціонального збагачення генів, який показує, що функціональні гени, пов'язані з метаболізмом вуглеводів, суттєво зменшились у мишей, оброблених Ace-K-самками (p Рис. 3. Функціональне збагачення генів аналіз, який показує, що функціональні гени, пов'язані з вуглеводним метаболізмом, були значно збільшені у мишей-самців, які отримували Ace-K (p Рис. 4. Кількісні гени, що кодують прозапальні медіатори, були значно збільшені у мишей-самців та жінок після споживання Ace-K (p Рис. 5. Споживання Ace-K змінило фекальний метаболом самок (A, B) та самців (C, D) мишей, як показано на хмарі та PLS-DA.