Протеомічне порівняння за допомогою iTRAQ у поєднанні з мас-спектрометрією білків яєчного білка у несучок (Gallus gallus) годують соєвим шротом та бавовняним шротом

Ролі Концептуалізація, курація даних, формальний аналіз, методологія, програмне забезпечення, перевірка, написання - оригінальний проект, написання - огляд та редагування

Поточна адреса: Університет Сичуань, Ченду, Сичуань, Китай

Ключова лабораторія прикордонної біотехнології Міністерства сільського господарства, Науково-дослідний інститут кормів, Китайська академія сільськогосподарських наук, Пекін, Китай

Ролі Курація даних, Формальний аналіз, Методологія

Ролі Збір даних, Програмне забезпечення

Розслідування ролей, адміністрування проектів, нагляд

Ролі Формальний аналіз, розслідування

Ролі Концептуалізація, методологія, адміністрування проектів, нагляд, написання - огляд та редагування

Дао Хе,
Хайджун Чжан,
Цзін Ван,
Шугенг Ву,
Хунюань Юе,
Гуанхай Ци

Цифри

Анотація

Бавовняне борошно (CSM) зазвичай використовується в раціоні курей для заміни соєвого шроту (SBM). Однак молекулярні наслідки цієї заміни залишаються незрозумілими. Щоб дослідити вплив цієї заміни на молекулярному рівні, iTRAQ у поєднанні з біохімічним аналізом проводили у курей Hy-Line W-36, доповнених змішаною дієтою CSM та SBM. Вага яєць, висота білка та одиниця Хау були значно зменшені в групі CSM100 (100% сирого білка SBM замінено CSM) порівняно з групою SBM (P Таблиця 1. Склад і рівні поживних речовин у раціонах курей-несучок з 40 до 51 тижнів віку.

Продуктивність, якість білків та колекція зразків

Параметри продуктивності та якості білка оцінювали під час випробування на годування 40–51 тижнів. Середня маса тіла несучок становила 1,76 ± 0,2 кг на початку випробування. Споживання корму та коефіцієнт конверсії корму (FCR, корм/яйце, г/г) вимірювали кожні два тижні, а продуктивність яєць, вага і смертність яєць реєстрували щодня.

В кінці випробування годування з кожної копії було зібрано п’ять яєць для визначення показників якості білка. Висоту білка та HU визначали за допомогою аналізатора яєць (ORKA Food Technology Ltd, Рамат Хашарон, Ізраїль). Всі результати були отримані при кімнатній температурі.

В кінці 51-го тижня випадково відбирали по одній несучці з кожної копії. Кров відбирали через крилову вену та центрифугували при 3000 × g протягом 10 хв для збору сироватки, яку потім зберігали при –20 ° C до аналізу. Шари негайно приносили в жертву шляхом вивиху шийки матки. Магнат яйцепроводу вирізали і зафіксували у 10% забуференному нейтральному формаліні (Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd., Пекін, Китай) відповідно.

Оцінка морфології великого яйцепроводу та аналіз гормонів

Для гістопатологічних досліджень зразки яйцепроводу, закріплені формаліном (магнум), фарбували гематоксиліном та еозином (ВІН). Всі використовувані реагенти були аналітичного класу (Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd., Пекін, Китай). Гістопатологічні зміни досліджували за допомогою світлового мікроскопа (BX51, Olympus Corp., Токіо, Японія). Гістопатологічну оцінку проводив кваліфікований персонал кафедри ветеринарної патології Пекінського сільськогосподарського університету. Концентрацію прогестерону та естрогену в плазмі крові аналізували за допомогою йоду [125I] естрадіолу та набору прогестеронових радіоімуноаналізів (Пекінський північний інститут біологічних технологій, Пекін, Китай).

Перетравлення трипсину та маркування iTRAQ

Аналіз за допомогою Q-Exactive мас-спектрометра та обробка даних

Інтерпретація та кількісне визначення даних

Для обробки даних ми використовували програмне забезпечення Proteome Discoverer 1.2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) для інтерпретації файлів необроблених даних, отриманих за допомогою мас-спектрометрії. База даних білка CHICK була завантажена з бази даних NCBI та поєднана із зворотними послідовностями та послідовностями широко розповсюджених забруднень, таких як кератини людини. Параметри пошуку в базі даних були наступними: трипсином було обрано фермент; два пропущені розщеплення були дозволені максимум; толерантність маси попередника була встановлена на 15 ppm; допуск маси фрагмента встановлено 20 мму; карбамідометилювання цистеїну було встановлено як фіксовану модифікацію; окислення метіоніну та мітки iTRAQ 4plex на N-кінцях та на бічних ланцюгах лізину були дозволені як динамічна модифікація. Був застосований суворий принцип максимального парсимонізму, і лише збіги пептидного спектру (PSM) з високою або середньою достовірністю та з дельта-Cn, що перевищувала 0,15, розглядалися для групування білків. Піки іонів інтегрували на основі найбільш впевненого центроїда з допуском 20 ppm. За допомогою зворотної бази даних коефіцієнт помилкового виявлення був встановлений на 0,01, щоб отримати високий рівень достовірності.

Кількісну оцінку білка проводили також за допомогою програми 1.2 Proteome Discoverer, яка автоматично обчислювала відносну кількість мічених iTRAQ пептидів та відповідних білків. Для кількісного визначення враховувались лише унікальні та високо впевнені пептиди. Для виправлення упередженості піпетування або визначення концентрації білка у змішаних зразках всі співвідношення білків нормалізували на середнє співвідношення білка. Мінімально значущі порогові значення регулювання становили 1,2. Білки із співвідношенням ≥1,2 або ≤0,833 розглядаються як диференційовано експресовані білки.

Вестерн-блот

Концентрацію білка супернатанту вимірювали за допомогою протеїнового аналізу Бредфорда. Зразки, що містять 30 мкг загального білка, розділяли 12% (мас./Об.) SDS-PAGE і переносили на мембрану PVDF (Millipore, Bedford, MA). Після інкубації протягом 1 години з блокуючим буфером (5% (мас./Об.) Нежирного молока в TBS-T (0,05% (об./Об.) Твін 20 у сольовому розчині, забуференному Tris), мембрану досліджували із зазначеними первинними антитілами, розведеними в блокуючий буфер протягом ночі при 4 ° С. Після ретельного промивання TBS-T мембрану інкубували з кон'югованим з пероксидазою хрону антитілом до кролика (Cell Signaling Technology), розведеним у блокувальному буфері (1: 2000), протягом 1 год при кімнатній температурі. Смуги візуалізували за допомогою хемілюмінесцентної підкладки Super Signal West Pico (Пірс) та записували на рентгенівські плівки (Fuji Medical, Токіо, Японія) .Нарешті, візуалізовані смуги кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення QUANTITY ONE на денситометрі GS-800 (Bio-Rad Антитіла, включаючи анти-овоінгібітор (ab193507), анти-лізоцим (ab391) та анти-авідин (ab6675), були придбані у компанії Abcam (Кембридж, Массачусетс, США).

Статистичний аналіз

Всі дані аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA), а середні показники порівнювали за допомогою багаторазового тесту Дункана (SAS Institute, 2001). Результати були представлені як середні значення ± SEM. Ефекти вважалися суттєвими, коли P Таблиця 2. Ефективність, якість білків та концентрація прогестерону та естрогену в плазмі у курей, що харчуються дієтами, складеними із соєвого шроту (SBM), та дієтами, які замінюють 50% або 100% вмісту сирого білка в SBM на бавовняну муку ( CSM50 або CSM100) у віці 51 тижня.

Гістологічні зміни та концентрація гормонів у плазмі крові

Гістологічні ураження не спостерігались у тканинах яйцепроводу курей серед усіх груп. Депресивний ріст трубчастих залоз та епітеліальних клітин спостерігався із збільшенням добавок CSM, особливо у групі CSM100 (рис. 1). Не було помітно різниці в рівнях прогестерону та естрогену в плазмі між групами CSM50 та SBM, тоді як рівень прогестерону був значно знижений у групі CSM100 (P Рис. 1. Гістопатологія маточного маточного яйця курей-несучок, яких годували дієтами, складеними із соєвого шроту (SBM) та дієти, які замінювали 50% або 100% вмісту сирого білка SBM на бавовняну муку (CSM50 або CSM100) у віці 51 тижня.

(Фарбування ВІН. А, В та С представляють групи SBM, CSM50 та CSM100 відповідно. Збільшення А1, В1 та С1 200 ×; Збільшення А2, В2 та С2 400 ×) G: клітина трубчастої залози; Е: епітелій.

Клітини трубчастих залоз були більшими в групі SBM, ніж у групі CSM100, а секреторні гранули поблизу верхівки більшості епітеліальних клітин, як правило, були меншими в групі CSM100 і містили менш флокулентний матеріал, ниткоподібний або гранульований. Менше миготливих клітин також спостерігалося в епітеліальному шарі в групі CSM100.

Ідентифікація, кількісне визначення та аналіз білка

За допомогою мас-спектрометрії з високою прохідністю 95 білків було остаточно ідентифіковано з яєчного білка за допомогою 12813 мас-спектрів (Подробиці в таблиці S1). В білку яєць були виявлені як білки з великою кількістю, включаючи овальбумін, овотрансферрин, овомуцин, овоінгібітор, лізозм, так і білки з низьким вмістом, включаючи CEPU-Se, тенасцин, фібриноген та ди-N-ацетилхітобіазу тощо. Тим часом 39 ідентифікованих білків перекривались порівняно з результатом двох попередніх досліджень [6,7], таких як лізоцим курки, овукоїд та білок, пов’язаний з ангіопоетином.

За даними тегів iTRAQ, між яєчним білком курей, які годувались на дієті CSM100, та тих, що годували дієтою SBM, спостерігали 17 диференційовано експресованих білків, які змінилися більш ніж у 1,2 рази (табл. 3). У поєднанні з результатами інструментів iTRAQ ми отримали точний кількісний результат за допомогою іонів-репортерів (рис. 2). Порівняно з групою SBM, 15 білків були регульованими вниз, тоді як 2 білки були регульованими вгору в групі CSM100. Для кращого розуміння диференційовано експресованих білків між групами SBM та CSM100 базу даних Uniprot та Gene Ontology [12] використовували для анотації 17 білків. Результати показали, що 15 відновлених білків брали участь у різних біологічних процесах та функціях, таких як антибактеріальна або антивірусна активність, метаболічний процес, процес імунної системи, біологічна адгезія, реакція на подразник, розмноження, біологічна регуляція. Наприклад, поліпептид Ig J та попередник протромбіну відіграють важливу роль у процесі імунної системи, реакції на подразник. Попередник овомуцину відіграє значну роль у біологічній адгезії. Овальбумін та овомуцин важливі для в’язкості та властивості гелю яєчного білка (табл. 3). Регульовані 2 білки були пов’язані з організацією клітинних компонентів або біогенезом.

Білки аналізували відповідно до іонів y та b, таких як y1, y2, y3 та y4 в овомуцині. Кількісні дані були розраховані з піків, отриманих для іонів-репортерів, які показані праворуч.

Диференціальна експресія білка та перевірка за допомогою Вестерн-блот

Для підтвердження результатів iTRAQ, 3 диференційовано експресованих білка; для валідації було обрано овоінгібітор, лізоцим та авідин. Результати показують ті самі зміни у маркуванні iTRAQ (рис. 3).

A, B являють собою CSM100 та SBM, відповідно.

Обговорення

Це дослідження показало, що годування CSM може спричинити зниження продуктивності несучості та якості білків. Зв'язок між масою яєць та масою білка вище, ніж зв'язок між масою яєць та масою шкаралупи або жовтка [13], і зменшення маси яєць в першу чергу було пов'язано зі зменшенням маси білка [14]. Наше дослідження підтвердило, що вага білка також суттєво знизився в групі CSM100 порівняно з контрольною групою.

HU обчислюється на основі висоти внутрішнього товстого білка та маси яєць [15]. HU та висота білка є важливими факторами, що оцінюють якість білка [16]. HU значно зменшився в яйцях курей, які годували 187 г/кг CSM [17]. Зниження висоти HU та білка в нашому дослідженні означало зниження якості білка яєць у групі CSM100. Результати показують, що окремий білок яєчного білка може знижуватися в дієті CSM100 через молекулярні механізми, що спричиняють втрату якості білка.

Кластерин - це тип шаперону, що міститься в біологічних рідинах, включаючи сперму, сечу та плазму людини. Розгорнуті або частково складені білки призводять до того, що яєчний білок втрачає в’язку природу. Кластерин може призвести до взаємодії та стабілізації незгорнутих або частково складених білків, інгібуючи осадження або агрегацію цих білків [25]. Збільшення рівня кластерину може поліпшити стабілізацію частково розгорнутих білків, таким чином покращуючи стабільність білка та продовжуючи тривалість зберігання яєць. Кластерин залишався на стабільному рівні при зберіганні 4 ° C, але зникав при високотемпературних умовах зберігання, а якість білків знижувалася. Зниження кластерину було запропоновано бути ефективним біомаркером для оцінки якості яєць при високотемпературному зберіганні [8]. У попередніх дослідженнях повідомлялося про зниження якості білків, таких як розвиток забарвлення білка у яєць, що зберігаються, завдяки дієті CSM [4,18,26]. У нашому дослідженні знижений рівень кластерину в групі CSM100 може надати додаткові докази того, що якість білка в яєцях, що зберігаються, знижується у несучок, які харчуються дієтою CSM.

Шість знижених білків: овальний білок, овотрансферрин, овомуцин, лізоцим, овоінгібітор та кластерин складають майже 80% білків яєчного білка і дуже пов'язані з в'язкістю густого білка [31]. Висота білка та HU вимірюють в’язкість яєчного білка [32]. Таким чином, ці білки з великим вмістом білка можуть зіграти важливу роль у зменшенні висоти білка та якості білка у групі CSM100, вказуючи на високу кореляцію між висотою білка та їх інтенсивністю в яєчних білках. Цікаво відмітити, що у групі CSM100 було виявлено, що чотири білки, пов’язані з імунітетом, включаючи область С ланцюга Ig, поліпептид Ig J, варіабельну область важкого ланцюга Ig та важку ланцюг Ig альфа. Ці білки з низьким вмістом беруть участь у реакції на подразник, процес імунної системи і можуть відігравати біологічну роль у підтримці цілісності яєчного білка, захищаючи ранній ембріональний розвиток [1].

Попередні дослідження припустили, що прогестерон та естроген пов'язані із синтезом овальбуміну, овотрансферину, овукоїду, лізоциму та авідину [33,34]. Рівні прогестерону та естрогену в плазмі не спостерігались у групі CSM50, але рівні прогестерону були значно знижені у групі CSM100. Прогестерон відіграє важливу роль у зростанні епітеліальних клітин та клітин трубчастих залоз великого магнуму [34,35]. У курей яйцепровід магнум, як правило, відомий як місце утворення синтезу яєчного білка. Результати вказували на менший ріст епітеліальних клітин та клітин трубчастих залоз у групі CSM100 порівняно з контрольною групою. Таким чином, гістологічні дані відповідали даним плазмових гормонів, демонструючи, що дієта CSM100 може спричинити зниження рівня прогестерону в плазмі у курей. Це зменшення ще більше уповільнило клітини трубчастих залоз та ріст епітеліальних клітин у великій яйцеводі протягом періоду годування. Також було помічено зменшення синтезу білка яєчного білка. Щодо сотень білків у яєчних білках, необхідні подальші дослідження, оскільки можна знайти мало досліджень між конкретним типом клітини магнуму та синтезованими білками [35].

В даний час мало досліджень, спрямованих на білки яєчного білка в результаті різних типів білків у дієтах курей. Молекулярні зміни, описані в цьому дослідженні, можуть пояснити причину біохімічних змін та запропонувати кращі критерії вибору суміші для курячих кормів для отримання більш поживного рівня виробництва.

Висновки

Це дослідження інтегрує традиційні харчові, гістологічні та протеомічні підходи для виявлення впливу CSM на якість білка. Дієта CSM100 негативно вплинула на продуктивність курей-несучок та якість білка. У цьому дослідженні виявлено 15 білків, які беруть участь у різних біологічних функціях, включаючи антимікробну активність, гелеутворюючі характеристики, імунні реакції, інгібування осадження білка, інгібування протеази та зв’язування або транспорту іонів металів, що може відігравати важливу роль у зниженні якості білків у групі CSM100 . Зменшення білка яєчного білка було спричинене зростанням нижньої трубчастої залози та клітинами епітелію великої яйцепроводу, коли курей годували дієтою CSM100. Це дослідження продемонструвало на молекулярному рівні, що SBM не слід повністю замінювати CSM у раціоні курей.

Після експерименту решту курей годували з використанням контрольної дієти в нормальних умовах годівлі, як описано в частині Методу.