Потенційний потенціал перехідного рецептора епітеліального Mg 2+ Меластатин 6 регулюється дієтичним вмістом Mg 2+ та естрогенами

Анотація

Mg 2+ є другим за поширеністю внутрішньоклітинним катіоном і відіграє важливу роль як фактор у багатьох ферментативних реакціях (1). Гомеостаз Mg 2+ залежить від балансу між кишковим всмоктуванням, нирковою екскрецією та обміном з кісткою (2). Регулювання загального балансу Mg 2+ в організмі в основному знаходиться в нирках, що точно відповідає абсорбції Mg 2+ в кишечнику. Приблизно 80% від загальної кількості Mg 2+ у плазмі фільтрується в клубочках (3,4), більшість з яких згодом реабсорбується вздовж нефрону (5). Вісімдесят п’ять відсотків відфільтрованого Mg 2+ реабсорбується пасивно в проксимальних канальцях і товстій висхідній кінцівці Генле (TAL). Дистальний звивистий канальчик (DCT) реабсорбує 5-10% відфільтрованого Mg 2+, і швидкість реабсорбції в цьому сегменті визначає кінцеву концентрацію Mg 2+ у сечі. Транспорт Mg 2+ в ДКТ має трансклітинну природу і на нього впливають дієтичні обмеження Mg 2+ та ряд гормонів (6,7). Однак молекулярні деталі та регуляція цього шляху залишаються в основному невідомими (5,6,8,9).

Спадкові порушення з первинною гіпомагніємією значно полегшили ідентифікацію транспортерів іонів епітелію в нирках. Наприклад, з'ясування генетичної основи ізольованої домінантної гіпомагніємії та гіпомагніємії з вторинною гіпокальціємією призвело до ідентифікації γ-субодиниці Na +, K + -ATPase та епітеліального перехідного потенціалу рецептора мелатотину 6 Mg 2+ (TRPM6) відповідно (10–12). TRPM6, який є членом надродини TRP, локалізується вздовж апікальної мембрани DCT. Гетерологічна експресія в ембріональній нирці людини 293 клітин TRPM6, але не TRPM6 мутантів, виявлених у пацієнтів з гіпомагніємією із вторинною гіпокальціємією, індукує Mg 2+-проникний катіонний канал, який жорстко регулюється внутрішньоклітинною концентрацією Mg 2+ (13). TRPM6 демонструє найвищу гомологію з TRPM7, який був ідентифікований як проникний іонний канал Mg 2+, який в першу чергу необхідний для клітинного гомеостазу Mg 2+ (13–15).

За аналогією з активним (повторним) поглинанням Ca 2+ у дистальній частині нефрону та тонкої кишки через епітеліальні канали Ca 2+ (транзиторний потенціал рецептора ванілоїд 5 [TRPV5] та TRPV6) (16), процес трансцелюлярного Mg Транспорт 2+ передбачається наступними послідовними кроками. Рухаючись сприятливим трансмембранним потенціалом, Mg 2+ потрапляє в епітеліальну клітину через апікальний епітеліальний канал Mg 2+ TRPM6. Далі Mg 2+ дифундує через цитозоль, який активно екструдується через базолатеральну мембрану (13). Молекулярна ідентичність цих останніх транспортерів Mg 2+ невідома. Більшість фізіологічних досліджень віддають перевагу Na + -залежному механізму обміну (17). Вхід Mg 2+, схоже, є кроком, що обмежує швидкість, і місцем регулювання.

Метою нашого дослідження було визначити місця активного поглинання Mg 2+ у мишей, досліджуючи профіль експресії TRPM6. Крім того, ми встановили, чи регулюється TRPM6 вмістом у їжі Mg 2+ та кальціотропними гормонами 17β-естрадіолом (17β-E2), 1,25-дигідроксивітаміном D3 (1,25 (OH) 2D3) та паратиреоїдним гормоном (PTH) . Вплив дієтичного вмісту Mg 2+ вивчали шляхом аналізу регуляції TRPM6 на рівні мРНК та білка та екскреції Mg 2+ та рівнях сироватки у мишей C57BL6, які годувались дієтами з дефіцитом Mg 2+, нормальними та збагаченими.

Матеріали і методи

Дослідження на тваринах

Для оцінки експресії мРНК TRPM6, TRPM7 та TRPV6 у різних тканинах ми побудували панель кДНК. З цією метою було вбито чотирьох мишей C57BL6, які годували повноцінним раціоном, що містив 0,2% Mg 2+ (мас./Мас .; SSNIFF spezialdiäten GmbH, Соест, Німеччина); були зібрані нирки, селезінка, мозок, серце, скелетні м’язи, печінка, легені, шлунок, кістки, дванадцятипала кишка, тонка кишка, клубова кишка, сліпа кишка та товста кишка; і виділяли загальну РНК. Щоб вивчити вплив дієтичного вмісту Mg 2+ на експресію TRPM6 та TRPM7 у нирках та товстій кишці, ми годували мишей C57BL6 (вік 12 тижнів) протягом дієти з дефіцитом 10 da Mg 2+ (0,005% мас./Мас. Mg), Mg 2+ -нормальна дієта (0,19% мас./Мас. Mg) або збагачена Mg 2+ (0,48% мас./Мас. Mg; SSNIFF spezialdiäten GmbH). Протягом останніх 24 годин дієтичного лікування тварин утримували в клітинах з метаболізмом і збирали 24-годинну сечу. Після закінчення дієтичного лікування брали зразки крові і вбивали тварин. Тканини нирок і товстої кишки відбирали і негайно заморожували в рідкому азоті.

Вплив 17β-E2 на рівень експресії мРНК TRPM6 у нирках оцінювали підставленими, двосторонніми оваріектомізованими (OVX) та щурами OVX, які отримували 2 × 500 мкг 17β-E2/д, як описано раніше (18). Вплив ПТГ вивчали підроблені, паратиреоїдектомізовані (РТХ) та РТХ щури, які отримували 6 одиниць/день бичачого ПТГ, як описано раніше (19). Крім того, ефект 1,25 (OH) 2D3 вивчали мишами, що нокаутують 1α-гідроксилазу (1α-OHase -/-), гетерозиготними (1α-OHase +/−) мишами, які фенотипово ідентичні мишам дикого типу, та 1α-OHase -/- мишей, доповнених внутрішньочеревно 1,25 (OH) 2D3, як описано раніше (20). Колегія з питань етики тварин Університету Радбоу Неймеген затвердила всі експериментальні процедури.

Кількісний аналіз ПЛР у реальному часі

Загальну РНК екстрагували з нирок, повних сегментів кишечника та інших тканин за допомогою реагенту для ізоляції загальної РНК TriZol (Life Technologies BRL, Бреда, Нідерланди) відповідно до протоколу виробника. Отриману РНК піддавали обробці ДНКазою (Promega, Madison, WI) для запобігання забрудненню геномної ДНК. Після цього 2 мкг РНК транскрибували реверсною транскриптазою вірусу лейкозу Молоні-Миша (Invitrogen), як описано раніше (21). КДНК використовували для визначення рівнів експресії мРНК TRPM6, TRPM7 та TRPV6, а також рівні мРНК господарського гена гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази (HPRT) як ендогенного контролю. Рівні експресії мРНК визначали за допомогою ПЛР у режимі реального часу на системі виявлення послідовності ABI Prism 7700 (PE Biosystems, Роткройц, Швейцарія). Праймери та зонди, які націлені на гени, що цікавлять, були розроблені за допомогою комп'ютерної програми Primer Express (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія) і перелічені в таблиці 1.

Послідовності праймерів і зондів Такмана для кількісної ПЛР в режимі реального часу

Аналіз поглинання In Vivo 45 Ca 2+

Кишкове всмоктування Ca 2+ оцінювали у двох групах мишей C57BL6 шляхом вимірювання кількості 45 Ca 2+ у сироватці крові на ранніх етапах часу після перорального введення (15 мкл/г маси тіла). Миші голодували протягом 12 год перед тестом. Під час експерименту тварини були гемодинамічно стабільними під наркозом. Розчин, який використовували для вимірювання поглинання Ca 2+, містив 0,1 мМ CaCl2, 125 мМ NaCl, 17 мМ Tris (pH 7,4) та 1,8 г/л фруктози і збагачувався 20 мкСі 45 CaCl2/мл (18 Ci/г; New England Nuclear, Ньютон, Массачусетс). Одна група отримувала розчин 45 Ca 2+ з добавкою MgCl2 до кінцевої концентрації 10 мМ, тоді як розчин 45 Ca 2+ групи 2 не доповнювала MgCl2. Зразки крові отримували з різними інтервалами часу (2, 4, 8 та 12 хв). Радіоактивний 45 Ca 2+ аналізували в сироватці (10 мкл) методом рідинного сцинтиляційного підрахунку. Зміна концентрації Ca 2+ у сироватці розраховували за вмістом 45 Ca 2+ у зразках сироватки та питомою активністю введеного Ca 2+ .

Аналітичні процедури

Сироватку Mg 2+ та Ca 2+ вимірювали за допомогою набору для колориметричного аналізу згідно з протоколом виробника (Roche Diagnostics, Woerden, Нідерланди). Екскреція Mg 2+ та Ca 2+ із сечею визначалася за допомогою атомно-абсорбційної спектрофотометрії на Perkin Elmer AAnalyst 300 (Perkin Elmer, Milano, Italy).

Імуногістохімія

Імуногістохімічне фарбування проводили на 7-мкм кріосекціях зразків нирок, зафіксованих перйодат-лізин-параформальдегідом. Зрізи фарбували очищеною за спорідненістю морською свинкою анти-TRPM6, як описано раніше (13). Фотографії всієї кори були зроблені за допомогою флуоресцентного мікроскопа Zeiss (Sliedrecht, Нідерланди), оснащеного цифровою фотокамерою (Nikon DMX1200). Для напівкількісного визначення рівня білка зображення аналізували за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень Image Pro Plus 4.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD), в результаті чого кількісно визначали рівні білка як середнє значення інтегральної оптичної щільності (22).

Статистичний аналіз

Значення виражаються як середнє значення ± SEM. Відмінності між групами перевіряли за допомогою односторонньої ANOVA та додатково оцінювали, використовуючи процедуру багаторазового порівняння Фішера. Відмінності в засобах з поглинанням P 2+ щодо трансцелюлярного поглинання Ca 2+, ми кількісно визначили рівні експресії мРНК TRPM6, TRPM7 та TRPV6 у різних сегментах кишкового тракту миші шляхом ПЛР-аналізу в реальному часі та представили їх відносно їх загальної кількості кишкова експресія. Високоселективний канал Ca 2+ TRPV6 формує верхівковий механізм входу в активному всмоктуванні Ca 2+ у тонкому кишечнику. TRPM6 експресувався переважно у сліпій кишці та товстій кишці, тоді як жодної експресії не виявляли в дванадцятипалій кишці та тонкій кишці (малюнок 1C). TRPM7 однаково виражався в різних сегментах кишкового тракту. Епітеліальний канал Ca 2+ TRPV6 експресувався переважно в дванадцятипалій кишці, сліпій кишці та товстій кишці, але не виявлявся в тонку кишку та клубову кишку (Малюнок 1C).

Профіль експресії транзиторних потенційних рецепторів меластатину 6 (TRPM6) та TRPM7 в різних тканинах миші. (A та B) Рівні експресії мРНК TRPM6 та TRPM7 у панелі тканин миші вимірювали за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі. (C) Кількісне визначення рівнів експресії мРНК TRPM6 (▪), TRPM7 (□) та перехідного потенціалу рецептора ванілоїду 6 (TRPV6) (▒) уздовж кишкового тракту представлено як відсоток від загальної експресії мРНК кишечника. МРНК, кількісно визначена за допомогою ПЛР-аналізу в реальному часі, обчислюється як відношення до рівня РНК гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази (HPRT). Дані представлені як середні значення ± SEM (n = 4).

Аналіз сечі та сироватки мишей, що харчуються, різні дієти Mg 2+

Мишей протягом 10 днів годували дієтою з дефіцитом Mg 2+ (0,005% мас./Мас.), -Нормальною (0,19% мас./Мас.) Або збагаченою (0,48% мас./Мас.) Дієтою. Наприкінці цього періоду мишей утримували протягом 24 годин у метаболічних клітинах і відбирали зразки сечі для дослідження електролітного обміну Mg 2+ та Ca 2+. Концентрація Mg 2+ та Ca 2+ у сироватці крові та загальна екскреція Mg 2+ та Ca 2+ із сечею показані на малюнках 2 та 3 відповідно. Дієта з дефіцитом Mg 2+ призвела до значної гіпомагніємії (рисунок 2B), тоді як значення Ca 2+ у сироватці крові не суттєво змінилося у мишей, які годували різними дієтами Mg 2+ (малюнок 2A). Дієтичне обмеження Mg 2+ суттєво зменшило екскрецію Mg 2+ і Ca 2+ із сечею порівняно з мишами, які харчувались нормальною дієтою Mg 2+ (рис. 3). Дієта, збагачена Mg 2+, суттєво збільшила екскрецію Mg 2+ та Ca 2+ із сечею, порівняно з мишами, яких годували нормальним харчуванням.

Вплив дієтичного вмісту Mg 2+ на загальну екскрецію Mg 2+ та Ca 2+ із сечею. Чиста екскреція із сечею Mg 2+ (A) та Ca 2+ (B) мишей на дієті з дефіцитом Mg 2+ (0,005% мас./Мас.), Нормальної дієти Mg 2+ (0,19% мас./Мас.) Та Дієта, збагачена Mg 2+ (0,48% мас./Мас.) Значення представлені як середні значення ± SEM (n = 6). * P # P 2+ на 45 Ca 2+ Поглинання

Щоб дослідити, чи дієтичний Mg 2+ конкурує зі швидкістю поглинання Ca 2+, двом групам мишей C57BL6 перорально вводили розчин 45 Ca 2+, який містив 0,1 мМ Ca 2+ з 10 мМ MgCl2 або без нього. Зміни концентрації 45 Ca 2+ у сироватці крові (ΔμM) вимірювали протягом 10 хв після введення розчинів 45 Ca 2+. Істотних відмінностей у швидкості поглинання 45 Ca 2+ не спостерігалося між групою, якій вводили розчин 45 Ca 2+, що містив надлишок Mg 2+, і групою, яка отримувала лише розчин 45 Ca 2+ (Рисунок 4).

Вплив дієтичного вмісту Mg 2+ на поглинання Ca 2+. Зміни концентрації 45 Ca 2+ у сироватці крові (ΔμM) протягом 10 хв після введення 45 Ca 2+ пероральним введенням мишам C57BL6. Дані є усередненими значеннями ± SEM (n = 5) від 12-тижневих мишей. ⋄, 0,1 мМ Ca 2+; ▪, 0,1 мМ Ca 2+ + 10 мМ Mg 2+ .

Вплив дієтичного вмісту Mg 2+ на експресію TRPM6 та TRPM7

Вплив дієтичного вмісту Mg 2+ на рівень експресії нирок TRPM6 та TRPM7. (A та B) Кількісну ПЛР у реальному часі використовували для визначення рівнів експресії мРНК TRPM6 та TRPM7 у нирках мишей, які годувались дієтою з дефіцитом Mg 2+ (0,005% мас./Мас.), Mg 2+ - нормальною дієтою (0,19% мас.)/мас.) та збагачена Mg 2+ дієта (0,48% мас./мас.). (C і D) Рівень білка TRPM6 визначали за допомогою комп’ютерного аналізу імуногістохімічних зображень і представляли як інтегральну оптичну щільність (IOD). Дані представлені як середні значення ± SEM (n = 6). * Вміст P + на експресії мРНК TRPM6 та TRPM7 у товстій кишці миші. Рівень експресії мРНК TRPM6 (A) та TRPM7 (B) мРНК у товстій кишці мишей, що харчувались дієтою з дефіцитом Mg 2+ (0,005% мас./мас.), Mg 2+ - нормальною дієтою (0,19% мас./мас.) та Mg Дієта, збагачена 2+ (0,48% мас./Мас.), Оцінювали кількісним ПЛР-аналізом у реальному часі та обчислювали як відношення до РНК HPRT. Дані представлені як середні значення ± SEM (n = 6). * Р 2+ дієта.

Вплив дієтичного вмісту Mg + на експресію мРНК TRPM6 та TRPM7 у товстій кишці миші. Рівень експресії мРНК TRPM6 (A) та TRPM7 (B) мРНК у товстій кишці мишей, що харчувались дієтою з дефіцитом Mg 2+ (0,005% мас./мас.), Mg 2+ - нормальною дієтою (0,19% мас./мас.) та Mg Дієта, збагачена 2+ (0,48% мас./Мас.), Оцінювали кількісним ПЛР-аналізом у реальному часі та обчислювали як відношення до РНК HPRT. Дані представлені як середні значення ± SEM (n = 6). * Р 2+ дієта.

Гормональна регуляція експресії TRPM6 та TRPM7 у нирках

Для визначення впливу кальціотропних гормонів, включаючи 1,25 (OH) 2D3, PTH та 17β-E2, на рівні експресії мРНК нирок TRPM6 та TRPM7 використовували різні тваринні моделі. Миші 1α-OHase -/- представляють унікальну тваринну модель для вивчення впливу гормону 1,25 (OH) 2D3 (23). Для дослідження ефекту PTH та 17β-E2 ми використовували щури PTX та OVX відповідно (18,19). Кількісна ПЛР у режимі реального часу продемонструвала, що рівні експресії мРНК TRPM6 нирок залишаються незмінними у 1α-OHase -/- порівняно з 1α-OHase +/− мишами та 1α-OHase -/- мишами, доповненими 1,25 (OH) 2D3 (рис. ). Подібним чином, ефекту ПТГ не спостерігалося (рис. 7С). Однак у нирках щурів, які овариектомізовані (OVX), вимірювали дворазове зниження рівня експресії мРНК TRPM6 (рис. 7Е). Важливо, що введення 17β-E2 нормалізувало рівень експресії TRPM6 у нирках щурів OVX. Жодних відмінностей у рівні ниркової експресії мРНК TRPM7 не спостерігалося у тварин 1α-OHase -/-, PTX та OVX (Рисунок 7, B, D та F).

Вплив 1,25-дигідроксивітаміну D3 (1,25 (OH) 2D3), паратгормону (PTH) та 17β-естрадіолу (17β-E2) на експресію мРНК каналів TRPM6 та TRPM7 у нирках. Вплив 1,25 (OH) 2D3, PTH та 17β-E2 на рівні експресії мРНК TRPM6 (A, C та E) та TRPM7 (B, D та F) визначали кількісно за допомогою ПЛР-аналізу та нормалізували для експресії HPRT. Дані представлені як середні значення ± SEM (n = 4 - 5). * Транспорт P 2+. По-перше, цей епітеліальний канал Mg 2+ експресувався переважно в епітелії мишей, включаючи нирки, сліпу кишку, товсту кишку та легені. По-друге, 17β-E2 спеціально регулював експресію мРНК TRPM6 у нирках, вказуючи на перший магнезіотропний гормон у підтримці балансу Mg 2+. По-третє, виснаження Mg 2+ збільшило експресію мРНК TRPM6 у нирках, тоді як збагачена Mg 2+ дієта збільшила рівень мРНК TRPM6 у товстій кишці. По-четверте, велика експресія TRPM6 у сліпій кишці та товстій кишці разом з низьким рівнем експресії в дванадцятипалій кишці та тонкій кишці свідчить про те, що активне всмоктування Mg 2+ відбувається переважно в дистальній частині кишечника.

Попередні звіти продемонстрували, що ПТГ стимулює реабсорбцію Mg 2+ у TAL та DCT (43,44). Крім того, показано, що 1,25 (OH) 2D3 посилює приплив Mg 2+ у клітинній лінії DCT миші (5). Наше дослідження припускає, що ПТГ та 1,25 (ОН) 2D3 не беруть участі в стимуляції реабсорбції Mg 2+ через регуляцію ниркових рівнів експресії TRPM6, оскільки 1,25 (ОН) 2D3 та ПТГ не змінювали експресію TRPM6 у нирках. Крім того, Karbach (45,46) продемонстрував, що клітинний транспорт Mg 2+ у товстій кишці щурів не реагує на 1,25-дигідроксивітамін D3.

Незмінені рівні експресії мРНК TRPM6 у товстій кишці під час обмеження Mg 2+ свідчать про те, що абсорбційна здатність Mg 2+ є достатньою для отримання максимального міжклітинного транспорту Mg 2+. Повсюдна експресія TRPM7, яка не реагує на дієту, свідчить про те, що цей конкретний канал Mg 2+ не бере участі у позаклітинному гомеостазі Mg 2+. Відповідно до попередніх досліджень, це вказує на те, що TRPM7 бере участь головним чином у клітинному гомеостазі Mg 2+ (14,15).

Цікаво, що, крім нирок та кишечника, TRPM6 має велику кількість в легеневій тканині. Однак точна функція TRPM6 у цьому органі ще залишається з’ясованою. Важливість Mg 2+ у легенях підтверджується тим фактом, що споживання Mg 2+ з їжею безпосередньо пов'язане з функцією легенів, реактивністю дихальних шляхів та симптомами дихання у загальній популяції (53). Більше того, лікування пацієнтів з хронічною астмою в даний час приділяється увазі через роль Mg 2+ у розслабленні артеріальних та бронхіальних клітин гладких м’язів (54–56). Подальші дослідження, безумовно, необхідні для визначення точної функції TRPM6 у фізіології легенів (патології).

Висновок

TRPM6 експресується переважно в нирках, сліпій кишці, товстій кишці та легенях, що свідчить про те, що ці органи беруть участь переважно в (ре) поглинанні Mg 2+. Крім того, ми надаємо докази того, що кишкова ділянка активного всмоктування Mg 2+ знаходиться переважно в дистальній частині кишечника. Крім того, 17β-E2 та дієтичний Mg 2+ позитивно беруть участь у регуляції TRPM6, підкреслюючи функцію воротаря цього епітеліального каналу Mg 2+.

Подяка

Це дослідження було підтримане Голландським фондом нирок (C02.2030, C03.6017) та Нідерландською організацією наукових досліджень (Zon-Mw 016.006.001).

Ми дякуємо NV Organon Nederland за те, що люб’язно надали ниркову тканину в рамках дослідження моделі OVX на щурах. Крім того, ми дякуємо доктору Рене Сент-Арно за те, що люб’язно надав ниркову тканину з моделі миші 1α-OHase -/- та доктору Марлі Корнеліссен за стимулювання дискусій.