Підрахунок калорій у обмеженні дієти дрозофіли

Кюн-Цзінь Мін

1 Департамент екології та еволюційної біології, Університет Брауна, Провіденс, штат РІ 02912 США

Томас Флатт

1 Департамент екології та еволюційної біології, Університет Брауна, Провіденс, штат Рі, 02912, США

Індрек Кулаотс

2 Кафедра інженерії, Університет Брауна, Провіденс, штат Р.І.

Марк Татарський

1 Департамент екології та еволюційної біології, Університет Брауна, Провіденс, штат РІ 02912 США

Анотація

Вважається, що продовження тривалості життя обмеженням дієти у дрозофіли відбувається без обмеження калорій. Тут ми безпосередньо вимірюємо калорії, засвоєні мухами при дотриманні повноцінних та обмежених дієт. Ми виявили, що споживання калорій зменшується на всіх дієтах, які продовжують тривалість життя. Мухи на дієті з низьким вмістом дріжджів довгоживуть і споживають близько половини калорій мух на дієтах з високим вмістом дріжджів, незалежно від енергетичного змісту самої дієти. Оскільки споживання калорій корелює з концентрацією дріжджів і, отже, з надходженням кожного метаболіту в цей харчовий компонент, передчасно робити висновок щодо дрозофіли, що калорії не пояснюють продовження тривалості життя.

1. Вступ

Скорочення споживання їжі без недоїдання подовжує тривалість життя багатьох організмів, включаючи дріжджі, нематоди, плодові мухи та гризунів (Koubova and Guarente, 2003; Masoro, 2000; Partridge et al., 2005). У гризунів зменшення споживання загальної кількості калорій продовжує тривалість життя, однак обмеження певних поживних речовин також може збільшити рівень виживання (Miller et al., 2005; Yu and Masoro, 1985; Zimmerman et al., 2003). Зараз триває суперечка щодо того, чи обмеження калорій є особливістю харчування, що відповідає за тривалий термін життя плодової мухи, Drosophila melanogaster. У нещодавній роботі з вирішення цього питання Mair et al. (2005) одночасно маніпулювали дієтичними дріжджами та цукром, щоб змінювати якість поживних речовин та калорійність. Виживання було значно збільшено на дієтах, які обмежували дріжджі, зберігаючи при цьому цукор постійним, тоді як тривалість життя мало змінювалася, коли цукор обмежувався в дієтах з постійною кількістю дріжджів. Примітно, Mair та співавт. обгрунтовували, що фактичне споживання калорій було рівним для жінок, яким давали дієти з однаковою енергетичною цінністю, оскільки одиночні тестові жінки розширюють свій хоботок на однакові тривалості. Оскільки жінки на ізокалорійних дієтах з низьким вмістом дріжджів живуть довше, ніж на дріжджах із високим вмістом, автори стверджують, що обмеження дієти (ДР) опосередковує тривалість життя, оскільки обмежує певні поживні компоненти дріжджів, а не калорії.

Висновок Mair та співавт. вимагає, щоб фактичне споживання калорій було пропорційним енергетичному вмісту дієтичного середовища. Однак взаємозв'язок між розширенням хоботка та споживанням поживних речовин невідомий, і останні дослідження підтверджують, що споживання їжі може не бути постійним для різних дієт, що змінюються в концентрації дріжджів або цукру (Carvalho et al., 2005; Min and Tatar, 2006a). Вважається, що жінки збільшують і зменшують швидкість прийому їжі при обмеженому харчуванні. Таким чином, можливо, що фактичне споживання калорій буде відрізнятися серед жінок у залежності від концентрації дріжджів, коли їм пропонують дієти з подібною енергетичною цінністю.

Щоб перевірити, чи енергетична цінність дієтичних середовищ пропорційна фактичному споживанню калорій, ми повторили експерименти з маніпуляцій з дієтою Mair et al. і одночасно вимірювали виживання та потік калорій. Повний енергетичний бюджет міг би вимірювати калорії за рахунок метаболізму, виведення, зміни маси тіла та загального розподілу яєць. Ми не враховуємо швидкість метаболізму, оскільки вона не відрізняється між повноцінними та DR D. melanogaster (Hulbert et al., 2004). Ми не враховуємо екскременти; наскільки ця швидкість відрізняється між процедурами, ми, якнайбільше, недооцінимо розбіжність між фактичним потоком калорій та енергетичною цінністю дієти. Отже, на практиці ми вимірюємо калорійність як загальну енергетичну цінність яєць та тканин тіла протягом п’яти днів, а також для кожного з типів дієти, описаних у Mair et al. (2005).

2. Матеріали та методи

2.1. Демографія та ЗМІ

Личинки штаму Canton-S вирощували на стандартному середовищі з кукурудзяної муки/цукру/дріжджів/агару (Elgin and Miller, 1980), доповненого кількома зернами живих дріжджів. Нещодавно закритих дорослих людей збирали протягом 48 годин і їх призначали до демографічних клітин об'ємом 1 л до щільності 200 особин (100 самок, 100 чоловіків). Флакони з їжею (25 X 95 мм) прикріплювали до кожної клітки за допомогою пластикової трубки розміром 25 мм і міняли кожні 2 дні, після чого мертвих мух виймали, сексували та реєстрували. Для кожної з чотирьох дієтичних процедур було встановлено три клітки-копії. У клітках підтримували 25 ° C, 40% відносної вологості та 12-годинний цикл світло-темрява.

Склад кожної дієти відповідає розробці Mair та співавт. (2005), хоча наші засоби масової інформації також містять рівномірну концентрацію кукурудзяної муки (табл. 1). Кукурудзяна мука діє як колоїд для підтримки однорідності поживної цукрової та дріжджової суміші. Сухі дріжджі SAF, що були автолізовані, були придбані у корпорації Lesaffre Yeast Corporation (Мілуокі, Вісконсин). Енергетичний вміст середовища розраховується з урахуванням індивідуальної калорійності та пропорційного внеску кожного компонента. Дріжджі з високим вмістом цукру та низьким вмістом дріжджів/високим вмістом цукру були «ізокалорійними» при приблизно 99 ккал/100 мл.

Таблиця 1

Склад дієти, калорійність та встановлена тривалість життя.

Дієтичне лікування Склад (у 100 мл води) Енергія у 100 мл середовища, ккал Середня тривалість життя, д (95% ДІ)

Високі дріжджі/Високий цукор	16 г дріжджів, 16 г сахарози, 5,2 г кукурудзяної крупи	146,8	30 (30 - 34)
Високі дріжджі/низький рівень цукру	16 г дріжджів, 4 г сахарози, 5,2 г кукурудзяної крупи	98,8	32 (30 - 34)
Низькі дріжджі/Високий цукор	4 г дріжджів, 16 г сахарози, 5,2 г кукурудзяної крупи	98,8	46 (42 - 48)
Низькі дріжджі/низький рівень цукру	4г дріжджів, 4г сахарози, 5,2г кукурудзяної муки	50,8	48 (46 - 48)

2.2. Колекція тіла та яєць для бомбової калориметрії

Личинки штаму Canton-S вирощували, як описано вище. Після еклозії 250 самок та 50 чоловіків були відсортовані в демографічні клітини 1L; чотири копії клітин плюс одна запасна були встановлені для кожного дієтичного лікування. Щільність випадків повторень залишалася незмінною, замінюючи мертвих мух дорослими однолітками із запасної клітки для лікування. Ми вимірювали калорійність самок у кожній копії як калорії всіх яєць, відкладених від еклозії (нульовий день) до п’ятого дня, плюс калорії всіх дорослих в кінці п’ятого дня. Оскільки клітини були встановлені з дорослими, які розробляли одну і ту ж дієту, але до того, як вони споживали будь-яку дієту для дорослих, відмінності в енергетичній цінності тканини на п’ятий день відображають відмінності, спричинені дорослими, які харчуються різними дієтами.

Яйця збирали з посуду з харчовими середовищами (60 X 15 мм), які прикріплювались 25-міліметровою пластиковою трубкою та лійкою до кожної клітки. Страви міняли щодня, яйця мили безкоштовно, сушили ліофілом та зважували. На п’ятий день страви з їжі виймали протягом чотирьох годин, перш ніж ми збирали дорослих, щоб переконатися, що мухи не містять неперетравленої їжі. Всіх самок з кожної клітки сушили ліофілізацією та зважували.

2.3. Калориметрія

Ми використовували калориметрію згоряння (наприклад, Lamprecht and Schmolz, 1999; Schmolz et al., 2005), щоб визначити вміст тепла в тілах та яйцях, поєднаних у репліках. Кожні зразки змішували з калориметричним н-тетрадеканом (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі) при масовому співвідношенні 1: 5 (зразок: тетрадекан) і спалювали в статичному калориметрі кисневої бомбової калориметри (Parr Instrument, Moline, IL; модель No 1341). Попередньо ми визначили оптимальну кількість н-тетрадекану для запалення зразків комах до повного згоряння, і ми розрахували чисту калорійність зразка шляхом віднімання відомої теплоємності грунтовки.

3. Результати

Тривалість життя (табл. 1) та виживання (рис. 1А) збільшилася у жінок, які дотримувались дієт з розведеними концентраціями дріжджів (медіана виживання: низькі дріжджі, 46 д; високі дріжджі, 32 д; тест Log-Rank, χ 2 = 333,7, р 2 = 2,01, р = 0,16). Дієта з низьким вмістом дріжджів/високим вмістом цукру та дієта з високим вмістом дріжджів/низьким вмістом цукру має однакову калорійність (табл. 1), але мухи, що харчуються цими дієтами, мають істотно різну тривалість життя, як повідомляють Mair et al. Ми будуємо наші результати (Рисунок 1B) у тому ж форматі, що і Mair et al. та резюмувати їх опубліковані результати.

(А) Довговічність. Зменшення вмісту дріжджів у раціоні набагато більше впливало на тривалість життя, ніж зменшення вмісту цукру в раціоні. (Б) Віртуальні калорії: Діаграма середньої тривалості життя щодо енергетичної цінності дієти. Дані представлені у форматі на малюнку 3 у Mair et al. (2005). (C) Асимільовані калорії: Діаграма середньої тривалості життя (серед повторюваних середніх значень та середніх значень) відносно калорійності тіла та відкладених яєць на душу населення (серед повторюваних середніх значень та середніх значень). Співвідношення між тривалістю життя та засвоєними калоріями є сильним та значним.

На відміну від цих результатів, мухи, які харчуються ізокалорійною дієтою, насправді помітно відрізняються за асимільованими калоріями. Коли приплив енергії вимірюється підрахунком калорій мух соми та яєць, вироблених протягом 5 днів, калорійність на муху більша для мух, яких годують дріжджовим харчуванням, ніж мух, які харчуються бідною дріжджами дієтою. Існує сильна кореляція між тривалістю життя та калорійністю (R 2 = 0,98, F (1,2) = 109,99, p = 0,009, рисунок 1C).

Ми також спостерігали закономірності засвоєння поживних речовин, які вирішують питання компенсаційного харчування. Суха вага жіночого тіла та яєць, відкладених протягом 5 днів, була більшою у мух, які годували дріжджами, багатих на їжу (рис. 2), але ступінь цього впливу залежала від концентрації цукру в їжі. Мухи, що харчуються з високим вмістом дріжджів, давали більше яєць, коли в раціоні було менше цукру, ніж високо. Подібним чином, дієта з високим вмістом дріжджів/низьким вмістом цукру давала більше яєць і набирала більшу вагу, ніж мухи, що годували їх з низьким вмістом дріжджів/з високим вмістом цукру, хоча ці дієти мали однаковий енергетичний вміст.

Масу самок (яєчників та незрілих яєць включно) та вироблених яєць оцінювали від еклозії через 5 днів. Високо дріжджі викликають високу несучість і збільшення ваги. Зверніть увагу, що низький вміст цукру ще більше підвищує несучість.

4. Обговорення

Споживання їжі досліджувалося впродовж десятиліть перетворення D. melanogaster на експериментальну модель, хоча вона не використовувала жодної дієти, яка продовжує тривалість життя (Driver et al., 1986; Edgecomb et al., 1994; Tatar, 2007). Про перше дослідження із затримки старіння шляхом обмеження дієти було повідомлено лише кілька десятків років тому (Chippindale et al., 1993). Самки, які отримували відносно розведений розчин харчових дріжджів, продовжували тривалість життя на 25–30% і одночасно відкладали менше яєць. Хоча розбавлене середовище, імовірно, зменшувало споживання дріжджів, годування не вимірювалось. Подібним чином, ця рання конструкція не ставила за мету відрізнити вплив калорій відносно ефекту від конкретних метаболітів дріжджів. Дослідження для вирішення цих питань з’явилися лише в останні роки.

Наша власна група одночасно вимірювала тривалість життя та швидкість годування злучених самок, які підтримували постійну дієту з однорідним цукром на основі агару з різними концентраціями автолізованих дріжджів (Min and Tatar, 2006a). Тривалість життя була найбільшою при дієті з 2% дріжджів і поступово менше, оскільки концентрація дріжджів зростала. Ми розрахували швидкість годування на основі поглинання розчинного, не засвоюваного барвника. Жінки на 16% дріжджів споживали в чотири рази більше дієти (барвника), ніж жінки на 2% дієті. Ця непропорційна різниця у споживанні свідчить про те, що концентрована дріжджова дієта не лише забезпечує високий рівень споживання їжі, але й стимулює поведінку годування, можливо, у відповідь на метаболічні потреби підвищеної несучості.

Різні результати бачили Carvalho et al. (2005), де незайманим жінкам були представлені середовища, які варіювались як у цукрі, так і у дріжджових екстрактах; виживання було найбільшим при 1% цукрово-дріжджовій дієті. Споживання вимірювали поглинанням розчинного нуклеотидного CTP [α- 32 P] індикатора. На відміну від наших спостережень, швидкість годування зростала при поступовому розведенні дієт. Таким чином, жінки на 1% дієті їли менше їжі (індикатор), але споживана кількість становила лише 4/10-го споживання, виміряного на 15% -й цукрово-дріжджовій дієті. Годування стимулювали при низьких концентраціях дієти, можливо тому, що ці середовища знижували як цукор, так і дріжджі, або тому, що компенсаційне годування відбувається за відсутності розмноження. Наші нові дані також припускають, що існує компенсаційне годування, коли вміст цукру знижується, тому що мухи, які харчуються дієтою з високим вмістом дріжджів/низьким вмістом цукру, набирають більшої маси та виробляють більше яєць, ніж мухи, які харчуються на дієті з високим вмістом дріжджів/високим вмістом цукру.

Цей висновок вимагає, щоб засвоєння поживних речовин було пропорційним концентрації поживних речовин у раціоні. Наші дані тут не підтверджують цього припущення. Як повідомлялося, тривалість життя сильно збільшилася на дієтах із зниженою концентрацією дріжджів, і мало було впливу на виживання від дієт зі зниженим вмістом цукру, і коли ми складаємо дані про тривалість життя щодо енергетичної цінності дієти, ми підсумовуємо результати Mair et al. (2005). Однак жінки, які дотримуються ізокалорійних дієт, не засвоювали однакову кількість калорій. Жінки, які харчуються з низьким вмістом дріжджів, споживають майже половину калорій жінок, які харчуються високодріжджовим раціоном, і тривалість життя була сильно корельована з засвоєними калоріями. Таким чином, жінки на дієті з низьким вмістом дріжджів споживали менше калорій, менше дріжджів і повільно старіли. З цієї експериментальної конструкції передчасно виключати калорії як визначальний фактор життя дрозофіли, оскільки споживання калорій з дріжджів точно змішується із споживанням усіх метаболітів у дріжджах.

Зрештою, може знадобитися ставитися до мухи більше, як до гризунів: безпосередньо контролювати споживання їжі або чітко вимірювати засвоєні поживні речовини. Фактично експериментальне регулювання споживання їжі застосовувалося до середземноморської плодової мухи (Carey et al., 2002) та до домашньої мухи (Cooper et al., 2004). У цих відносно великих мух не було позитивного ефекту зменшення споживання поживних речовин на тривалість життя, на відміну від переваг. Масштабування таких протоколів для вивчення ефекту певного прийому їжі з дрозофілою має бути пріоритетним завданням.

Подібним чином, барвники та мічені нуклеотиди в кращому випадку є частковими проксими споживання, оскільки вони лише позначають споживання розчиненої речовини. Доросла дрозофіла не має жувальних ротових апаратів, а нерозчинні метаболіти з дріжджів, вбудовані під поверхню середовища, відносно недоступні. Вимірювання стабільних ізотопів вуглецю та азоту з раціону може вирішити цю проблему і точно виміряти засвоєння поживних речовин та метаболічний потік. За допомогою таких методів було показано, що метелик Heliconius charitonius отримує необхідні амінокислоти з харчового пилку для виробництва яєць (O’Brien et al., 2003). Нещодавно ми адаптували цей підхід до дрозофіли, щоб визначити, як дорослі вживають цукор з раціону личинок (Min et al., 2006). Оборот вуглецю від харчового цукру, придбаного личинками, швидкий і майже повний у пулі метаболітів, що використовується для виробництва яєць, і в самій соматичній тканині дорослих. Застосовуючи цей підхід до вуглецю та азоту з дієтичних дріжджів, можна визначити, як специфічні метаболіти набуваються та виділяються для соматичного підтримання, коли обмеження дієти продовжує тривалість життя.

Намагання з'ясувати, як практика обмеження дієти при дрозофілі впливає на засвоєння поживних речовин, прогресують, але неповні. Зрозуміло, що розведення дієтичних дріжджів зменшує споживання їжі та продовжує тривалість життя. З іншого боку, ми ще не можемо вирішити вплив калорій від впливу метаболітів, характерних для дріжджів, не кажучи вже про те, щоб розрізнити вплив компонентів у дріжджах, таких як вуглеводи, стерини, жирні кислоти, вітаміни, мінерали та амінокислоти. Амінокислоти заслуговують на увагу, оскільки знижений вміст метіоніну продовжує тривалість життя щурів та мишей (Miller et al., 2005; Zimmerman et al., 2003). Чи можна покращити виживання D. melanogaster, обмежуючи дієтичні амінокислоти, залишається важко оцінити, оскільки певні раціони, оптимізовані для личинок, не підходять для дорослих (Lamb, 1978; Min and Tatar, 2006b). Можливо, іронічно, що, хоча інструменти для розкриття молекулярних основ метаболізму та старіння дрозофіли за останні роки надзвичайно просунулися, ми в даний час застрягли у фундаментальній проблемі гастрономії: як ми вимірюємо та контролюємо з’їдене мухою?

Подяка

Цю роботу підтримали Національний інститут охорони здоров’я, Медичний фонд Еллісона, Швейцарський національний науковий фонд та Науковий фонд Роше.

Виноски

Заява видавця: Це PDF-файл нередагованого рукопису, який прийнято до друку. Як послуга для наших клієнтів ми надаємо цю ранню версію рукопису. Рукопис пройде копіювання, набір версій та перегляд отриманого доказу, перш ніж він буде опублікований у остаточній формі. Зверніть увагу, що під час виробничого процесу можуть бути виявлені помилки, які можуть вплинути на вміст, і всі юридичні застереження, що стосуються журналу, стосуються.