Nrf2 пригнічує FGF21 під час тривалого ожиріння у мишей, спричиненого дієтою

Анотація

МЕТА Ожиріння характеризується хронічним окислювальним стресом. Фактор росту фібробластів 21 (FGF21) нещодавно був визначений як новий гормон, який регулює обмін речовин. Фактор 2, пов’язаний з NFE2 (Nrf2), є фактором транскрипції, який організовує експресію набору генів антиоксидантів та детоксикації як в базальних, так і в стресових умовах. Поточне дослідження досліджувало роль Nrf2 в мишачій моделі тривалого ожиріння, спричиненого високим вмістом жиру (HFD), та характеризувало його перехресні зв’язки з FGF21 у цьому процесі.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ Мишей дикого типу (WT) та Nrf2 (Nrf2-KO) годували HFD протягом 180 днів. У цей період вимірювали споживання їжі та масу тіла. Обмін глюкози оцінювали за допомогою внутрішньоочеревинного тесту на толерантність до глюкози та внутрішньочеревного тесту на толерантність до інсуліну. Загальну РНК готували з печінки та жирової тканини та використовували для кількісної RT-PCR у реальному часі. Плазму натще збирали та аналізували на наявність хімічних речовин крові. Клітинна лінія ST-2 була використана для досліджень трансфекції.

РЕЗУЛЬТАТИ Миші Nrf2-KO були частково захищені від індукованого HFD ожиріння і розвинули менш стійкий до інсуліну фенотип. Важливо, що миші Nrf2-KO мали вищий рівень FGF21 у плазмі крові та вищі рівні мРНК FGF21 у печінці та білій жировій тканині, ніж миші WT. Таким чином, змінений метаболічний фенотип мишей Nrf2-KO під HFD був пов'язаний з більш високою експресією та великою кількістю FGF21. Послідовно, надмірна експресія Nrf2 у клітинах ST-2 призводила до зниження рівня мРНК FGF21, а також до пригніченої активності репортера люциферази промотору FGF21.

ВИСНОВКИ Визначення Nrf2 як нового регулятора FGF21 розширює наше розуміння перехресних зв’язків між метаболізмом та захистом від стресу.

Фактор росту фібробластів 21 (FGF21) належить до сімейства атипових FGF, у яких відсутній звичайний гепарин-зв'язуючий домен (1,2) і, отже, може дифундувати від тканин походження, щоб функціонувати як гормони. FGF21 рясно експресується в печінці, підшлунковій залозі та білій жировій тканині (WAT) (3,4). Він сигналізує через клітинно-поверхневі комплекси рецепторів FGF з трансмембранним білком β-Klotho (5–8). На відміну від широко виражених рецепторів FGF, β-Klotho експресується в обмеженому наборі тканин, які включають печінку, WAT, підшлункову залозу та яєчка, таким чином, ймовірно, спрямовуючи активність FGF21 на ці органи-мішені (8,9).

Фармакологічні дослідження показали, що FGF21 має широкі метаболічні дії у ожирілих гризунів та приматів (вип. За 10). Трансгенні миші, які надмірно експресували FGF21 у печінці, мали покращену чутливість до інсуліну та кліренс глюкози, а також знижували концентрацію тригліцеридів у плазмі крові і були стійкими до збільшення ваги при харчуванні з високим вмістом жиру (HFD) (11). Подібні ефекти спостерігались у мишей, що страждають ожирінням, інсулінорезистентними ob/ob або db/db, або у цукрових діабетичних цукрів Цукера після введення рекомбінантного FGF21 (11,12). Введення FGF21 індукованим HFD мишам із ожирінням збільшило споживання жиру та витрати енергії та знизило концентрацію глюкози, інсуліну та ліпідів у плазмі крові, а також концентрацію тригліцеридів у печінці (11–13). FGF21 також покращував печінкову та периферичну чутливість до інсуліну як у худих, так і у індукованих HFD мишей із ожирінням (12). У діабетичних резус-мавп FGF21 спричиняв значне зниження рівня глюкози, інсуліну та тригліцеридів у плазмі натще, одночасно знижуючи рівень холестерину ЛПНЩ, підвищуючи рівень холестерину ЛПВЩ та спричиняючи помірну втрату ваги (14).

Через свій сприятливий вплив на вуглеводний та ліпідний обмін, FGF21 є кандидатом для лікування діабету 2 типу та метаболічного синдрому (10,15). Однак недостатньо відомо про регуляцію ендогенного FGF21 при метаболічних захворюваннях. З'ясування факторів, які контролюють експресію та активність FGF21 у нежирних та ожирених станах, може призвести до нових терапевтичних стратегій.

Фактор транскрипції хребетних NFE2, фактор 2 (Nrf2), є членом сімейства cap’n’collar, який став головним регулятором окислювально-відновного стану та реакцій детоксикації клітини (16–19). Система Nrf2 опосередковує як регулювання базової антиоксидантної здатності, так і реакцію на стрес під час гострих окисних процесів. У мишей та культивованих клітин людини індукуються десятки захисних генів у відповідь на окислювальні та електрофільні хімічні проблеми в залежності від Nrf2 (версія 20). Активований стресом Nrf2 посилює транскрипцію своїх цільових генів, зв'язуючись з послідовностями елементів антиоксидантної відповіді в їх споріднених промоторах (21). На додаток до своїх повсюдних антиоксидантних та детоксикаційних цільових генів, Nrf2 також має групи тканин-специфічних мішеней. У печінці більшість цих генів кодує білки, специфічні для синтезу та метаболізму жирних кислот та інших ліпідів (22,23). Цікаво, що ці метаболічні гени в основному репресуються - а не індукуються - Nrf2 за допомогою невідомих механізмів.

З огляду на роль Nrf2 як регулятора ліпідного гомеостазу, його фармакологічні маніпуляції можуть бути корисними при лікуванні метаболічних розладів, таких як дисліпідемія та ожиріння. Дійсно, активація Nrf2 синтетичним тритерпеноїдом CDDO-Im у мишей WT запобігала збільшенню маси жирової тканини, маси тіла та рівня тригліцеридів у сироватці крові, а також жирової печінки, спричиненої HFD; цей захист від ожиріння був скасований у тварин Nrf2-KO (23). Більше того, було показано, що статини активують Nrf2 у культурі клітин, а також in vivo (28,29), що може пояснювати деякі їх антиоксидантні ефекти (30). Важливо додатково з’ясувати механізми, за допомогою яких Nrf2 регулює метаболізм, та виявити системи метаболічного контролю, з якими він взаємодіє. Поточне дослідження досліджувало роль Nrf2 під час довготривалого (180 днів) СНЧ і визначило Nrf2 як новий регулятор FGF21 під час ожиріння, спричиненого ВЧР.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Миші C57BL6 J Nrf2 +/−, спочатку розроблені професором М. Ямамото (31), були отримані від RIKEN BRC (Цукуба, Японія). Мишей WT та Nrf2-KO генерували спаровуванням мишей Nrf2 +/− самців та самок; потомство генотипували, як описано раніше (31). Самців мишей WT та Nrf2-KO (віком 9–10 тижнів) годували стандартною дієтою (SD) (10 ккал% жиру) або HFD (60 ккал% жиру; Research Diets, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі) протягом 180 днів. Мишей розміщували у приміщенні для тварин медичної школи Університету Патри в приміщеннях з контролем температури, світла та вологості з 12-годинним циклом світло/темрява. Усі процедури на тваринах були схвалені інституційною комісією з огляду медичної школи Університету Патри та відповідали Директиві Європейської Комісії 86/609/ЄЕС.

Оцінка чутливості до інсуліну.

Глюкозу в крові вимірювали за допомогою глюкометра Precision Xceed (Abbott, Chicago, IL) у крові, зібраній з хвоста миші. Для оцінки толерантності до глюкози одну дозу г-глюкози (100 мг/мл у воді, 10 мл/кг) вводили внутрішньочеревно після 18 год голодування з вільним доступом до води. Для оцінки толерантності до інсуліну вводили разову дозу регулярного інсуліну Actrapid (Novo Nordisk, Копенгаген, Данія) (0,75 одиниць/кг) внутрішньочеревно через 4 години голодування з вільним доступом до води.

Вимірювання гормонів та метаболітів.

Плазму збирали з використанням гепарину як антикоагулянта і центрифугували при 2000 g протягом 20 хв при 4 ° C. Вимірювання плазми проводили згідно інструкцій виробника для кожного аналізу. Імуноферментні аналізи використовували для лептину в плазмі (ALPCO, Salem, NH), інсуліну (ALPCO) та FGF21 (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота). Нестерифіковані жирні кислоти (NEFA) вимірювали за допомогою набору NEFA C (Wako Chemicals, Осака, Японія), а β-гідроксибутират вимірювали за допомогою набору для аналізу β-гідроксибутирату (кетонового тіла) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Глюкозу, холестерин, холестерин ЛПВЩ та тригліцериди вимірювали за допомогою аналізатора Olympus AU640 (Гамбург, Німеччина).

Дослідження клітинної культури.

Кількісне визначення рівнів експресії генів.

Печінка та ВАТ були занурені відразу після збору в пізній розчин РНК (Ambion, Фостер-Сіті, Каліфорнія). Загальну РНК виділяли з використанням реагенту TRIzol (Invitrogen) та додатково очищали за допомогою міні-набору RNeasy (Qiagen, Hilden, Німеччина). Для запобігання забрудненню геномної ДНК був включений етап перетравлення ДНКази (TurboDNAse; Ambion). кДНК синтезували за допомогою системи першого ланцюга Superscript (Invitrogen), а ПЛР у реальному часі проводили в трьох примірниках на приладі Step One Plus (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія) з використанням аналізів експресії генів TaqMan на вимогу (Applied Biosystems): FGF21, Mm00840165_g1; PGC-1α, Mm00447183_m1; PEPCK, Mm00440636; PPARα, Mm00440939_m1; GAPDH, 4352339E. Відносні рівні мРНК розраховували методом порівняльного порогового циклу, використовуючи GAPDH (гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу) як ген ведення домашнього господарства. Відносні рівні експресії мРНК Nrf2 визначали методом RT-PCR SYBR Green (Applied Biosystems) і обчислювали методом відносної стандартної кривої, використовуючи TATA-зв'язуючий білок (TBP) як ген ведення домашнього господарства з раніше описаними праймерами (34).

Статистичний аналіз.

Миші Nrf2-KO на HFD менш стійкі до інсуліну, ніж миші WT. Наведені результати тестів на толерантність до глюкози та інсуліну у мишей WT та Nrf2-KO, які отримували HFD. Тести проводили на вихідному рівні (A, B) і через 30 (C і D) та 180 (E і F) днів на HFD. Дані є середніми ± SEM. n = 8 для кожного генотипу. * Рівні P s (P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Метаболічні параметри плазми мишей WT та Nrf2-KO годували SD або HFD протягом 180 днів