Серотонін покращує ожиріння у мишей, спричинене дієтою

Порівну сприяв цій роботі разом з: Хітосі Ватанабе, Тацуя Накано, Рйо Сайто

Лабораторія біології підвалу, Вища школа сільськогосподарських наук, Університет Тохоку, 1–1 Цуцумідорі Амаміямачі, Аоба-ку, Сендай, 981–8555, Японія

Порівну сприяв цій роботі разом з: Хітосі Ватанабе, Тацуя Накано, Рйо Сайто

Афілійована лабораторія харчових та біомолекулярних наук, Вища школа сільськогосподарських наук, Університет Тохоку, 1–1 Цуцумідорі Амаміямачі, Аоба-ку, Сендай, 981–8555, Японія

Афілійована лабораторія хімії продуктів тваринного походження, Вища школа сільськогосподарських наук, Університет Тохоку, 1–1 Цуцумідорі Амаміямачі, Аоба-ку, Сендай, 981–8555, Японія

Афілійована лабораторія харчування, Вища школа сільськогосподарських наук, Університет Тохоку, 1–1 Цуцумідорі Амаміямачі, Аоба-ку, Сендай, 981–8555, Японія

Приналежність тваринництва, Департамент біологічного виробництва, Токійський університет сільського господарства та технологій, Фучу-ши, Токіо, 183–8509, Японія

Афілійований відділ передової медицини та розвитку, BML Inc., Сайтама, 350–1101, Японія

Філіальний інститут біологічних, екологічних та сільських наук, Університет Аберіствіт, Кардіганшир, SY23 3DA, Великобританія

Хітоші Ватанабе,
Тацуя Накано,
Ріо Сайто,
Дайсуке Акасака,
Казукі Сайто,
Хідекі Огасавара,
Такесі Мінасіма,
Кохтаро Міядзава,
Такаші Каная,
Ікуро Такакура

Цифри

Анотація

Цитування: Watanabe H, Nakano T, Saito R, Akasaka D, Saito K, Ogasawara H, et al. (2016) Серотонін покращує ожиріння, спричинене дієтою, у мишей. PLoS ONE 11 (1): e0147143. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0147143

Редактор: Джулі А. Човен, Госпітальний інфантильний університет Ніньо Хесус, КІБЕРОБН, ІСПАНІЯ

Отримано: 2 вересня 2015 р .; Прийнято: 29 грудня 2015 р .; Опубліковано: 14 січня 2016 року

Наявність даних: Усі відповідні дані містяться в роботі.

Фінансування: Ця робота була підтримана грантом Міністерства сільського господарства, лісового та рибного господарства на науково-дослідний проект з розвитку сільськогосподарських продуктів та продуктів харчування (NARO) та Науковою стипендією (23.7413) для Програми молодих вчених від Японського товариства для Промоція науки (JSPS). Співавтор Коджджі Тахара працює в компанії BML Inc. Компанія BML Inc. надає підтримку у вигляді заробітної плати автору К.Т., але не відіграє жодної додаткової ролі у розробці дослідження, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису . Конкретна роль цього автора сформульована в розділі «Авторські внески».

Конкуруючі інтереси: Автори мають наступні інтереси: Співавтор Коджі Тахара працює в компанії BML Inc. Немає заявлених патентів, продуктів, що розробляються, або продуктів, що продаються. Це не змінює дотримання авторами всіх політик PLOS ONE щодо обміну даними та матеріалами.

Вступ

Серотонін (5-НТ) - це моноамінергічний нейромедіатор з діяльністю, що модулює центральну та периферичну функції. Перший етап синтезу 5-НТ із триптофану залежить від ферменту триптофану гідроксилази (ТРГ), який також є ферментом, що обмежує швидкість у його біосинтезі. Відомо, що TPH має дві ізоформи, TPH1 і TPH2 [1]. TPH1 в основному присутній в епіфізі, селезінці, тимусі та кишкових ентерохромафінових клітинах. TPH2 повністю експресується в нейрональних клітинах, таких як ядра рафа стовбура мозку. Периферійний 5-HT у мишей, що нокаутують TPH1, не може бути замінений 5-HT, синтезованим TPH2 у центральній нервовій системі [2]. Крім того, вважається, що 5-НТ на периферії не може пройти гематоенцефалічний бар'єр [3, 4]. Таким чином, існує дві незалежні системи організації 5HT: одна в центральній нервовій системі, а інша на периферії. 5-HT впливає на харчову поведінку та ожиріння в центральній нервовій системі, і там зберігається близько 2% 5-HT в організмі [5–10]. З іншого боку, периферичний 5-HT не був предметом такого інтенсивного дослідження, особливо щодо обміну жиру та ліпідів у організмі, хоча приблизно 98% 5-HT в організмі існує на периферії.

Скелетні м’язи відіграють важливу роль в енергетичному обміні та утилізації глюкози, особливо під час акцизу. Існування повільних і швидких ізоформ важкої ланцюга міозину спостерігається в нормальних зрілих м'язових волокнах. М'язові волокна повільного типу мають високу концентрацію мітохондрій і виробляють енергію шляхом окисного метаболізму. На відміну від цього, м’язові волокна швидкого типу використовують гліколіз як головне джерело АТФ [18, 19]. Β-коактиватор 1a (PGC-1a), що активується проліфератором пероксисомного проліфератора (PPAR), є основним коактиватором ядерних рецепторів PPARγ і є головним фізіологічним регулятором для специфікації м’язових волокон повільного типу [19–21]. Миші-нокаути PGC-1α, характерні для скелетних м’язів, суттєво погіршують толерантність до глюкози [22], тоді як у людей, що страждають ожирінням, відсоток м’язових волокон повільного типу значно нижчий, ніж у людей із нижчою жирністю [23].

Настійно рекомендується, що 5-НТ може бути ключовим фактором з точки зору енергетичного метаболізму в скелетних м'язах, оскільки недавнє дослідження показує, що агоніст 5HTR2 індукує підвищення активності промотору PGC-1α [24]. Для перевірки цих гіпотез ми дослідили вплив тривалого лікування мишей периферичним 5-НТ на ожиріння та енергетичний обмін скелетних м’язів у мишей на дієті з високим вмістом жиру.

Матеріали і методи

Дослідження на тваринах

Самців мишей C57BL/6 придбали у Japan SLC (Сідзуока, Японія). Усі миші були розміщені в приміщенні з контрольованою температурою (23 ° C) з 12-годинним циклом світло/темно та годувались дієтою чау (14,4 МДж/кг), що містить 4,8% жиру (Ch), або дієтою з високим вмістом жиру (17,0 МДж)/кг), що містить 13,6% жиру (F) (CLEA Japan, Inc., Токіо, Японія). Мишам вводили внутрішньовенно. із серотоніном (5-НТ) (0,1 мг, 0,5 мг або 1 мг) (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі) або забуференним фосфатом фізіологічним розчином (PBS) двічі на тиждень у віці від 5 до 26 тижнів. Масу тіла мишей вимірювали одночасно з введенням ін’єкцій. Миші голодували за 12 год до того, як у всіх експериментах збирали зразки крові та тканин. Споживання їжі у кожної групи мишей вимірювали протягом 5 днів, коли їм було 17 тижнів. Ректальну температуру вимірювали термометром (BAT-7001H; Physitemp Instruments Inc, Clifton, NJ) у віці 26 тижнів. Експерименти були дозволені Комітетом з охорони навколишнього середовища та безпеки університету Тохоку і проводились відповідно до Керівних принципів експериментів на тваринах Університету Тохоку, які були санкціоновані відповідним комітетом уряду Японії.

Відсоток жиру в організмі та внутрішньочеревного жиру

Частка жиру у всьому тілі визначалася методом Фолча. Весь внутрішньочеревний жир був видалений з тіла та зважений. Пропорції загального жиру в організмі та внутрішньочеревного жиру нормалізували відповідно до маси тіла.

Гістологія білих жирових тканин

Внутрішньочеревна біла жирова тканина була отримана від мишей у віці 26 тижнів. Ці тканини фіксували у 4% параформальдегіду/PBS (рН 7,2), а потім вносили у парафін. Фарбування гематоксилін-еозином внутрішньочеревної білої жирової тканини проводили, як описано раніше [13]. Розміри внутрішньочеревних білих адипоцитів визначали, вимірюючи двісті клітин на зразок (n = 5).

Аналіз хімії плазми

Зразки крові відбирали у мишей віком 26 тижнів (n = 7–12) у крижаних пробірках, що містять гепарин (10 одиниць/пробірка) (Мочіда, Токіо, Японія), і негайно центрифугували при 20000 г протягом 15 хв. Зразки плазми зберігали при -80 ° C до аналізу. Усі концентрації гормонів та метаболітів у плазмі крові вимірювались комерційно доступними наборами, поставленими Wako (Осака, Японія), крім концентрації лептину та адипонектину, що постачалися системами НДДКР (Міннеаполіс, Міннесота). Всі процедури проводились згідно з рекомендаціями виробника.

Тести на толерантність до глюкози та інсуліну

I.p. Тест на толерантність до глюкози проводили у мишей віком 23 тижні (n = 6). Глюкозу (Sigma) вводили внутрішньовенно. у дозі 2 мг/г маси тіла. I.p. Тест на толерантність до інсуліну проводили у мишей віком 25 тижнів (n = 6). Інсулін (Sigma) вводили внутрішньовенно. у дозі 0,225 Од/кг маси тіла. Зразки крові відбирали з каудальної вени кожної миші через 0, 15, 30, 60, 90 та 120 хв після обробки. Концентрацію глюкози та інсуліну у плазмі крові вимірювали за допомогою вищезазначених методів.

Непряма калориметрія

Обмін енергії всього тіла досліджували за допомогою непрямого калориметра з відкритим контуром (Arco-2000; Arco System, Chiba, Японія). Після калібрування системи за стандартними газовими сумішами мишей поміщали в окремі камери акрилового калориметра з вільним доступом до їжі та води. Витрати енергії, що визначаються як споживання кисню (VO2) та вироблення вуглекислого газу (VCO2), вимірювали протягом 24 годин з 16:00 годин при кімнатній температурі. Час аклімації становив 1 год. Виміри нормалізували за масою тіла.

Імуногістохімічний аналіз

М'язи гастрокнемія та підошви, отримані від мишей 14 тижнів, заморожували в ацетоні, охолодженому сухим льодом. Для того, щоб визначити тип скелетних м’язових волокон, кріосекції вирізали за допомогою кріостатного мікротома (Leica, Wetzlar, Німеччина) та піддали імуногістохімії. Зрізи імуно забарвлювали антиповільними (клон М 8421, 1: 600, Sigma) та антишвидкими (клон M 4276, 1: 300, Sigma) мооклональними антитілами важкої ланцюга міозину, специфічними маркерами типу I та типу II myofibers, відповідно. Як вторинне антитіло використовували гістофін Simplestain MAX-PO (M) (Нічирей, Токіо, Японія). Частка кожного типу клітковини визначалась у кожному відділі м’язів шлунково-кишкового та підколінного м’язів за допомогою фотомікроскопічної фотографії (Keyence) та програмного забезпечення Scion Image.

Фарбування NADH-тетразолій редуктази (NADH-TR)

Свіжозаморожені ділянки м’язів підошви та шлунково-кишкового м’яза у мишей у віці 14 тижнів кожної групи інкубували в 0,05 М трис-буфері (рН 7,2), що містив NADH (Kohjin Co., Ltd., Токіо, Японія) та нітороблу теторазолій (NBT) (Nacalai Tesque, Inc, Кіото, Японія) протягом 30 хв при 37 ° C. Потім фарбування очищали 50% ацетоном і консервували водним монтажним середовищем.

Аналіз співвідношення NAD +/NADH

М'язи підошви та шлунково-кишкового тракту були отримані від мишей віком 14 тижнів з кожної групи. Близько 5 мг кожного м'яза використовували для аналізу співвідношення NAD +/NADH. Концентрації NAD + та NADH вимірювали за допомогою набору для кількісного визначення NAD +/NADH (BioVision, Сан-Франциско, Каліфорнія). Процедуру проводили відповідно до інструкцій виробника.

Аналіз експресії мРНК

Загальну РНК екстрагували із заморожених зразків тканин за допомогою реагенту Trizol (Invitrogen, Co., Carlsbad, CA). кДНК синтезували із загальної РНК за допомогою набору зворотної транскрипції Superscript III (Invitrogen, Co., Carlsbad, CA) із використанням випадкових праймерів. Вимірювання ПЛР у реальному часі для окремих кДНК проводили за допомогою системи Thermal Cycler Dice Real Time System Single (Takara Bio Inc., Siga, Японія). Після інкубації протягом 10 с при 95 ° С, кДНК супроводжували ПЛР протягом 40 циклів (95 ° С, 5 с: 60 ° С, 30 с). Зелена флуоресценція SYBR була виявлена в кінці кожного циклу для моніторингу кількості продукту ПЛР, що утворюється протягом цього циклу. В кінці кожного циклу реєстрували профілі кривих плавлення. Стандартна крива кожного продукту слідувала за розрахунком відповідних експресій генів. Значення нормалізували до значень 18S рибосомної РНК. Послідовності праймерів наведені в таблиці 1.

Вплив антагоністів рецепторів серотоніну

Кетансерин (Sigma), антагоніст 5HTR2A, розчиняли в 0,1 М HCl, розбавляли PBS і вводили в дозованому об'ємі 0,1 мг/мишу. SB-204741 (Tocris Bioscience, Бристоль, Великобританія), антагоніст 5HTR2B, розчиняли в ДМСО, розбавляли PBS таким чином, що кінцева концентрація ДМСО становила 0,1%, і вводили в обсязі дозування 0,08 мг/мишу. SB-269970 (Sigma), антагоніст 5HTR7 та метисергід (Sigma), антагоніст 5HTR1, 2 та 7, розчиняли у PBS та вводили у дозованому об'ємі 0,6 та 0,1 мг/мишу відповідно. Всі антагоністи були i.p. вводять за 30 хв до ін’єкції 1 мг 5-НТ. Через 120 хв відбирали зразки скелетних м’язів.

Статистичний аналіз

Значення подаються як середні значення ± SE. Статистичний аналіз проводили за допомогою t-критерію Стьюдента або одностороннього та двостороннього ANOVA з подальшим тестом Tukey для оцінки статистичних відмінностей між групами. Значення Р менше 0,05 вважали статистично значущими.