Діабет 1 типу пов’язаний з зараженням ентеровірусом на слизовій оболонці кишечника

Анотація

Діабет 1 типу - одне з найпоширеніших хронічних захворювань у розвинених країнах, і його частота різко зросла з часів Другої світової війни. Це викликано селективним руйнуванням продукуючих інсулін β-клітин у підшлунковій залозі, опосередкованих імунологічними механізмами. Сприйнятливість до захворювання модулюється> 40 різними генами ризику, причому гени HLA вносять більше половини генетичної сприйнятливості. Фактори навколишнього середовища однозначно впливають на ризик захворювання та сприяють швидко зростаючим показникам захворюваності.

Зв'язок між діабетом 1 типу та ентеровірусною інфекцією широко вивчався. У кількох дослідженнях були виявлені ентеровіруси в крові та підшлунковій залозі хворих на цукровий діабет 1 типу, а також в перспективних дослідженнях (1–7). Недавнє відкриття генетичних поліморфізмів гена IFIH1 як факторів, що модулюють ризик діабету, ще більше посилило цю асоціацію, оскільки ці гени опосередковують розпізнавання ентеровірусів вродженою імунною системою (8,9). Поліморфізми, пов'язані з діабетом, схоже, пов'язані з сильною вродженою імунною відповіддю, що може призвести до посилення реакції запалення під час зараження вірусом (10). Інші вроджені гени імунної системи (мережа IRF7) також модулюють ризик розвитку T1D (11).

Часте виявлення вірусу у хворих на цукровий діабет свідчить про можливу роль стійкості вірусів. Персистенція ентеровірусу була описана раніше, наприклад, при хронічних кардіоміопатіях (12) та на тваринних моделях (13-16), де ентеровірус та інші пікорнавіруси можуть зберігатися протягом тривалого періоду. Ці дослідження показали, що ентеровірус може зберігатися як дволанцюжкова РНК без чіткого синтезу білка (15,17). З кількох вірусних захворювань відомо, що стійка інфекція зазвичай призводить до сильної вродженої імунної відповіді, місцевого запалення та імунно-опосередкованого пошкодження тканин.

Целіакія характеризується запаленням тонкої кишки, пошкодженням слизової та підвищеною проникністю слизової. Зв'язок між діабетом 1 типу та целіакією добре встановлена. Тому інтригуюче висловити гіпотезу, чи сприяють ентеровірусна інфекція та ентеропатія цій асоціації.

Незважаючи на недавній прогрес у цій галузі досліджень, невідомо, як ентеровіруси можуть спричинити селективну шкоду у продукуючих інсулін β-клітинах. Їх первинним місцем реплікації є слизова оболонка кишечника, з якої вірус може поширюватися в кров (первинна віремія) та інфікувати внутрішні органи. Однак можлива присутність ентеровірусів у кишечнику людини детально не вивчена. Нещодавно ми опублікували перше подібне дослідження, в якому припускають, що ентеровірус може бути присутнім у тонкій кишці у хворих на цукровий діабет 1 типу (18). Сучасне дослідження оцінює гіпотезу про те, що слизова оболонка кишечника є резервуаром стійкості ентеровірусу у хворих на цукровий діабет 1 типу, підтримуючи безперервний запальний стан, який може поширюватися на підшлункову залозу і відігравати вирішальну роль в індукованому ентеровірусом діабеті.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Навчальна серія.

Серія досліджень складалася із 120 осіб, які пройшли гастроскопію через різні шлунково-кишкові скарги. Біопсії слизової оболонки тонкої кишки брали з дистальної частини дванадцятипалої кишки для морфологічних аналізів та базових досліджень. Проби відбирали протягом періоду 1995–2000 рр. У відділенні гастроентерології Університетської лікарні Тампере. Зразки з фіксованим формаліном були доступні для всіх 120 досліджуваних і заморожені зразки від 86 суб'єктів.

Суб'єкти дослідження включали 39 хворих на цукровий діабет 1 типу, 40 хворих на целіакію, які не хворіли на діабет 1 типу, і 41 суб'єкт контролю, включаючи суб'єктів, які не мали жодного з цих захворювань, але мали неспецифічні шлунково-кишкові симптоми (25 диспепсія, 10 синдром подразненого кишечника, 3 афтозний стоматит, 1 виразковий коліт, 1 колагеновий коліт і 1 зрештою здоровий). Крім того, один контрольний суб’єкт мав псоріаз та одну IgA-нефропатію. Усі суб’єкти контролю не були діабетичними та не мали ознак целіакії (Таблиця 1).

Короткий зміст навчальних предметів

Діагноз діабету 1 типу базувався на критеріях Всесвітньої організації охорони здоров’я (19), і всі пацієнти перебували на лікуванні інсуліном. У шістнадцяти також була целіакія, 10 аутоімунних розладів щитовидної залози, 1 IgA-нефропатія, 1 хвороба Аддісона, 1 алопеція та 1 ревматоїдний артрит. Тривалість діабету варіювалась від 0 до 38 років (медіана 20 років; точна інформація доступна лише у 23 пацієнтів).

Целіакія була діагностована у досліджуваних шляхом позитивного результату ендомізіальних антитіл та атрофії ворсинчастої атрофії слизової оболонки тонкої кишки та гіперплазії склепи. Целіакія нещодавно була діагностована у всіх пацієнтів, і на момент біопсії всі вони сиділи на нормальній глютенової дієті. Один хворий на целіакію мав IgA-нефропатію, а один - гіпертиреоз.

Протокол дослідження був затверджений етичним комітетом Університетської лікарні Тампере. Усі випробувані дали інформовану згоду.

Гібридизація in situ.

Первинний скринінг ентеровірусу проводили на зразках біопсії, закріплених у формаліні та вкладених у парафін (зрізи 5 мкм), використовуючи аналіз гібридизації in situ (ISH), як описано раніше (4,18,20). Це базується на одному специфічному для ентеровірусу зонді, націленому на висококонсервативну загальнопоширену послідовність у 5′-некодуючій області ентеровірусного геному. Цей аналіз охоплює більшість, якщо не всі відомі типи ентеровірусу. Усі аналізи проводили сліпо щодо контролю стану пацієнтів. Позитивний сигнал гібридизації напівквантифікували шляхом підрахунку позитивних клітин на мікроскопічне поле у наступні категорії: негативні (відсутні позитивні клітини), слабкі позитивні (в середньому 1–10 позитивних клітин на мікроскопічне поле за допомогою 400-кратного збільшення), помірно позитивні (10– 100 позитивних клітин на поле) та сильних позитивних (> 100 клітин на поле).

Імуногістохімічне фарбування.

Ентеровірусна RT-PCR.

Для RT-PCR нефіксовані зразки біопсії зберігали замороженими в середовищі оптимальної температури різання при -70 ° C. Зразки біопсії виймали із середовища оптимальної температури різання та гомогенізували за допомогою гомогенізатора SilentCrusher S (Heidolph, Schwabach, Німеччина). РНК екстрагували за допомогою RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина). RT-PCR проводили за допомогою двох незалежних методів: раніше описаного методу, що ампліфікує послідовність, загальну для всіх відомих серотипів ентеровірусу (25), та RT-PCR у реальному часі з використанням тих самих праймерів та зондів. Зразок вважався позитивним ентеровірусом, якщо він дав позитивний сигнал принаймні в одному з цих аналізів.

Статистичний аналіз.

Статистичний аналіз проводили за допомогою SPSS 18.0 для Windows. Порівняння частот проводили за допомогою тестів Пірсона χ 2 та Фішера, а безперервні змінні аналізували за допомогою незалежного зразкового t-тесту.

РЕЗУЛЬТАТИ

Вперше проби біопсії тонкої кишки пройшли скринінг на наявність геному ентеровірусу за допомогою методу ISH. У сімдесяти чотирьох відсотках хворих на цукровий діабет 1 типу порівняно з 29% контрольних суб'єктів було виявлено, що вони вірусно позитивні (P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно
Завантажте PowerPoint

Суб'єкти, позитивні на РНК ентеровірусу за допомогою ISH у зразках біопсії тонкої кишки

Виявлення РНК ентеровірусу за допомогою ІСГ у біоптатах кишечника хворих на цукровий діабет 1 типу, включаючи слабко-позитивні (А), середньо-позитивні (В) та сильно-позитивні (С) випадки. D: Імуногістохімічне фарбування білка ентеровірусу VP1. Стрілки вказують на клітини, позитивні за вмістом РНК ентеровірусу (A) та білка VP1 (D). (Якісне цифрове зображення цього показника доступне в Інтернет-випуску.)

Маркери запалення у ISH + та ISH - суб'єкти

Суб'єкти з підвищеною щільністю CD3, αβ та γδ Т-клітин, експресія HLA-DR та трансглутаміназа 2-цільові відкладення IgA у слизовій оболонці кишечника

ОБГОВОРЕННЯ

Сучасне дослідження свідчить про те, що слизова оболонка кишечника хворих на цукровий діабет 1 типу часто інфікується ентеровірусами. Отримані дані добре поєднуються з вірусною стійкістю, явищем, яке зазвичай спостерігається при пікорнавірусних інфекціях, і яке може призвести до тривалого запалення та пошкодження тканин (26). Це спостереження також підтверджує наше попереднє дослідження, яке показало подібне явище у меншої групи хворих на цукровий діабет та контрольних суб'єктів (18).

Можливо, особи, схильні до діабету 1 типу, схильні до ентеровірусних інфекцій та їх стійкості. Теоретично така сприйнятливість може опосередковуватися генетичними факторами, що надають сприйнятливість до діабету 1 типу. Відомо, що деякі з цих генів сприйнятливості, такі як гени HLA та IFIH1, впливають на імунну реакцію проти ентеровірусів (9,31). Однак немає доступних досліджень щодо можливої ролі цих генів у розвитку стійкості ентеровірусу. У поточному дослідженні виявлення РНК ентеровірусу не було пов'язане з генами ризику HLA для діабету 1 типу, аргументуючи проти головного ефекту генів HLA. На додаток до генетичних факторів, як відомо, гіперглікемія схильна до інфекцій. Тому ми не можемо виключити можливість того, що діабет сам по собі може спричинити тривалі ентеровірусні інфекції. Однак виявлення ентеровірусу не було пов'язано з тривалістю цукрового діабету 1 типу, що побічно говорить проти такої можливості.

Інтенсивність фарбування та кількість позитивних клітин в ІСГ варіювали між досліджуваними групами, при цьому пацієнти з діабетом 1 типу виявляли значно сильніший позитив у порівнянні з хворими на целіакію та контрольними суб’єктами. Це свідчить про те, що вірус реплікується на більш високому рівні у хворих на цукровий діабет, виробляючи більше молекул РНК та інфікуючи більше клітин. Дуже слабкі позитивні результати були відносно частими також серед суб'єктів контролю захворювань, що дозволяє припустити, що низькоякісна інфекція могла сприяти виникненню неспецифічних шлунково-кишкових симптомів у деяких з них.

РНК вірусу було виявлено за допомогою різних методів, включаючи аналізи ISH та RT-PCR. Незважаючи на те, що вони давали паралельні результати, було очевидно, що позитивність до ентеровірусу частіше спостерігається при ІСГ, ніж при РТ-ПЛР. Це можна пояснити тим, що для цих двох методів були потрібні два окремі зразки біопсії, а також методологічними відмінностями у попередній обробці зразків та можливою присутністю інгібіторів ПЛР, які погіршують чутливість ПЛР (18).

На закінчення ми припускаємо, що стійка ентеровірусна інфекція на слизовій оболонці кишечника може відігравати певну роль у патогенезі діабету 1 типу. Слизова кишечника може бути важливим резервуаром вірусу, з якого вірус може поширюватися на підшлункову залозу, яка анатомічно дуже близька і має спільні лімфатичні та судинні мережі. Крім того, стійкість вірусів у слизовій оболонці кишечника може підтримувати хронічне запальне середовище в цій мережі, що може сприяти аутореактивності острівців за допомогою механізму активації сторонніми. Наприклад, γδ + Т-клітини, які були чітко пов’язані з наявністю ентеровірусу в слизовій оболонці кишечника, полегшують аутоімунітет при індукованому ентеровірусом міокардиті шляхом пригнічення активності Т-регуляторних клітин (32).

ПОДЯКИ

Це дослідження було фінансово підтримано грантами Фонду досліджень діабету серед неповнолітніх, Фонду Сольберга, Фонду Сігріда Юселіуса, Академії Фінляндії та Конкурентного фінансування досліджень Університетської лікарні Тампере. Крім того, частина дослідження фінансувалася проектом PEVNET (Європейська сьома рамкова програма GA-261441-PEVNET).