Чорна смородина пригнічує метаболічний синдром, спричинений дієтою з високим вмістом фруктози у щурів

Парк Джи Хун

1 Дослідницький центр з рідини для тіла "Hanbang", Університет Вонванг, Шиньон-дон, Іксан, Jeonbuk 570-749, Республіка Корея

Мін Чул Хо

1 Дослідницький центр з рідини для тіла, Hanbang, Університет Вонванг, Шиньон-дон, Іксан, Jeonbuk 570-749, Республіка Корея

2 коледж східної медицини та професійна вища школа східної медицини, Університет Вонванг, Шіньонг-донг, Іксан, Чонбук 570-749, Республіка Корея

Хе Йом Кім

Ти Мі Ан

Юн Юнг Лі

Dae Gill Kang

3 команда Brain Korea (BK) 21 Plus, Вища школа східної медицини, Університет Вонванг, Іксан, Jeonbuk 540-749, Республіка Корея

Хо Саб Лі

3 команда Brain Korea (BK) 21 Plus, Вища школа східної медицини, Університет Вонванг, Іксан, Jeonbuk 540-749, Республіка Корея

Анотація

1. Вступ

Метаболічний синдром - це захворювання, яке характеризується змінним співіснуванням ожиріння, гіперурикемії, гіперінсулінемії, гіпертонії та дисліпідемії. Патогенез метаболічного синдрому включає безліч органів серцево-ниркової системи [1]. Пацієнти з метаболічним синдромом, як визначено Національною освітньою програмою з холестерину III групи лікування дорослих (NCEP-ATP III), одночасно виявляють 3 або більше з наступних рис: збільшена окружність талії, підвищений артеріальний тиск, знижений ліпопротеїн високої щільності (ЛПВЩ) рівень, підвищений рівень тригліцеридів та гіперглікемія [2, 3].

Фруктоза, присутня в доданих цукрах, таких як сахароза та кукурудзяний сироп з високим вмістом фруктози, була епідеміологічно пов’язана з метаболічним синдромом. Збільшення споживання фруктози, яка зазвичай використовується в оброблених продуктах харчування та безалкогольних напоях, є одним з найважливіших факторів, що сприяють зростанню поширеності метаболічного синдрому [4]. Недавні результати показали, що дієтична фруктоза прискорює метаболічні порушення та викликає окислювальні пошкодження [5]. Дієта з високим вмістом фруктози викликає добре охарактеризований метаболічний синдром, що в основному призводить до гіперінсулінемії, гіпертонії, дисліпідемії та низького рівня ЛПВЩ [6]. Недавнє дослідження показало, що пошкодження нирок пов'язане з метаболічним синдромом [7]. Вплив на печінку високих рівнів фруктози призводить до швидкої стимуляції ліпогенезу та накопичення тригліцеридів, що призводить до зниження чутливості до інсуліну та печінкової резистентності до інсуліну/непереносимості глюкози [8].

Чорна смородина (Ribes nigrum; до н. Е.) - цінна садівнича культура в Росії, Польщі, Німеччині, Скандинавії, Англії, Новій Зеландії та ряді країн Східної Європи. Щорічне світове виробництво БК становить приблизно 500 000 - 600 000 тонн [9]. БК містить численні фізіологічно активні компоненти, включаючи вітаміни, каротиноїди та флавоноїди, які мають противиразкові, протисудомні та протидіарейні ефекти, а також захисний ефект проти карцином, діабету та регресивних захворювань [10, 11].

Кілька досліджень повідомляють, що БК має антиоксидантну дію. Антоціани від БК зменшують окислювальний стрес за допомогою Nrf2-опосередкованих антиоксидантних механізмів [12]. Крім того, екстракт БЦ має цитопротекторні та протизапальні властивості [13]. Більше того, БК захищає від каменів у нирках [14]. Однак терапевтичних ефектів БЦ у пацієнтів з порушенням обміну речовин не повідомляється. Таким чином, це дослідження було розроблене для виявлення впливу екстракту БЦ на метаболічний синдром, викликаний дієтою з високим вмістом фруктози, у щурів.

2. Методи та матеріали

2.1. Рослинний матеріал та приготування екстракту BC

Е. Був придбаний у ферми Гукмін (м. Чонгюп, Корея). Зразок ваучера (номер HBF191) був зданий на зберігання в Гербарій професійної вищої школи східної медицини Університету Вонкванг (Корея). До н.е. (400 г) кип'ятили 3 л дистильованої води при 100 ° С протягом 2 год. Отриманий екстракт фільтрували через фільтрувальний папір Whatman №3 і центрифугували при 990 × g протягом 20 хв при 4 ° C. Отриманий супернатант концентрували за допомогою роторного випарника, після чого отриманий екстракт (63,19 г) ліофілізували за допомогою морозильної сушарки і зберігали при -70 ° C до необхідності.

2.2. Експерименти на тваринах та дієта

Усі експериментальні процедури проводились згідно з Національним керівництвом Інституту охорони здоров’я з догляду та використання лабораторних тварин і були затверджені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин з медичних наук Університету Вонванг (номер затвердження: WKU 14-50). Шість тижнів самців щурів Sprague-Dawley (SD) отримували від Samtako (Осан, Корея) і утримували в приміщенні з автоматично підтримуваною температурою (23 ° C), вологістю (50–60%) та циклами світло/темно (По 12 годин кожен) протягом експериментів. Через 1 тиждень акліматизації щурів випадковим чином розподілили на 4 групи (10 щурів на групу). Контрольну групу (продовження) годували звичайною дієтою. Дієтичну групу з високим вмістом фруктози (ВЧ) годували 60% фруктозною дієтою (Research Diet, США). Групу з низькими дозами БК годували 60% фруктозною дієтою зі 100 мг/кг/добу до нашої ери, яку вводили перорально Сонде протягом 4 тижнів. Групу з високими дозами БК годували 60% фруктозною дієтою з 300 мг/кг/добу БК, що вводили перорально Сонде протягом 4 тижнів. Звичайна дієта складалася з 50% крохмалю, 21% білка, 4% жиру та стандартної суміші вітамінів та мінералів. Дієта з високим вмістом фруктози складалася з 60% фруктози, 20% білка, 10% жиру та стандартної суміші вітамінів та мінералів.

2.3. Вимірювання артеріального тиску

Систолічний артеріальний тиск (SBP) визначали за допомогою неінвазивної плетизмографії на хвостовій манжеті та реєстрували за допомогою автоматичного сфігмографа (MK2000; Muromachi Kikai, Токіо, Японія). SBP вимірювали один раз на тиждень. Протягом кожного сеансу вимірювання проводили щонайменше 10 визначень SBP. Значення представлені як середнє значення ± SEM 8 вимірювань.

2.4. Оцінка пероральної толерантності до глюкози

Два пероральні тести на толерантність до глюкози (OGTT) проводили через 2 дні через 8 тижнів лікування. Коротко, концентрацію базальної глюкози в крові вимірювали через 10–12 год нічного голодування, після чого глюкозу (2 г/кг маси тіла) негайно вводили перорально. Зразки крові хвостових вен відбирали через 30, 60, 90 та 120 хв після введення глюкози.

2.5. Забір крові та тканин

В кінці експериментів грудну аорту та м’язи відокремили, промили холодним сольовим розчином та заморозили. Плазму отримували з коагульованих зразків крові центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 15 хв при 4 ° C і заморожуванні при -80 ° C.

2.6. Параметри крові

Рівні тригліцеридів у плазмі вимірювали за допомогою комерційних наборів (AM 157S-K, ASAN, Корея). Рівні ЛПВЩ, загального холестерину та ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ) у плазмі крові вимірювали за допомогою наборів для аналізу ЛПВЩ та ЛПНЩ (E2HL-100, Bio Assay Systems, Німеччина). Рівні інсуліну в плазмі вимірювали за допомогою комерційних наборів (80-INSRT-E01, ALPCO, Великобританія). Рівні С-реактивного білка (CRP) у плазмі вимірювали за допомогою комерційних наборів (557825, BD Biosciences, Америка). Рівні лептину в плазмі вимірювали за допомогою комерційних наборів (ab100773, Abcam, Великобританія). Рівні T-Bill і BUN у плазмі вимірювали за допомогою комерційних наборів (77184, Arkray, Японія).

2.7. Підготовка аорти та вимірювання судинної реактивності

Грудну аорту швидко і ретельно збирали у кожного щура і поміщали в холодний розчин Креба (118 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,1 мМ MgSO4, 1,2 мМ KH2PO4, 1,5 мМ CaCl, 25 мМ NaHCO3, 10 мМ глюкози та рН 7,4) . З кожної грудної аорти видаляли сполучну тканину та жир. Кожну грудну аорту розрізали на кільця довжиною приблизно 3 мм. Було обережно захищено ендотелій від випадкових пошкоджень під час процедури розтину. Кільця аортального відділу грудної клітки суспендували в тканинній ванні, що містить розчин Креба, при температурі 37 ° C за допомогою 2 L-подібних дротів з нержавіючої сталі, введених у просвіт і провітрюваних 95% O2 і 5% CO2. Ізометричні сили кілець вимірювали за допомогою датчика переміщення сили Grass FT 03, підключеного до системи запису поліграфа Model 7E (Grass Technologies, Quincy, MA, USA). Визначено, що пасивне розтягування 1 г у грудних кільцях аорти є оптимальним натягом для максимальної чутливості до фенілефрину (10-6 М). Препаратам дозволяли врівноважуватись приблизно протягом 1 год із заміною розчину Креба кожні 10 хв. Вивчали релаксантну дію ацетилхоліну (ACh, 10 −9 –10 −6 M) та нітропрусиду натрію (SNP, 10 −10 –10 −5 M) на кільця грудної аорти.

2.8. Вестерн-блот-аналіз в аорті та м’язах щурів

2.9. Гематоксилін та еозин (Н & Е) та олійно-червоне фарбування аорти, епідидимального жиру та печінки

Тканину аорти грудної клітини від 5 випадкових суб'єктів з кожної групи фіксували у 10% (об/об) формаліні в 0,01 М солі, забуференному фосфатом (PBS), протягом 2 днів, причому розчин формаліну змінювали щодня для видалення слідів крові. Зразки тканини аорти зневоднювали і вбудовували в парафін, розрізали (6 мкм) і фарбували H & E. Епідидимальний жир (від 5 випадкових суб'єктів з кожної групи) та зразки тканини печінки (від 5 випадкових суб'єктів з кожної групи) фіксували у 4% параформальдегіді протягом 48 год при 4 ° C та інкубували з 30% сахарозою протягом 2 днів. Кожен зразок жиру та печінки вбудовували в сполуку ОСТ (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Торранс, Каліфорнія, США), заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C. Заморожені зрізи вирізали за допомогою малого та середнього бізнесу Shandon Cryotome SME (Thermo Electron Corporation, Пітсбург, Пенсільванія, США) і встановлювали на предметних стеклах, покритих полілілізином. Зрізи епідидимального жиру фарбували H & E, тоді як зрізи печінки фарбували маслом червоного O. Для кількісного гістопатологічного порівняння кожен зріз аналізували за допомогою програмного забезпечення Axiovision 4 Imaging/Archiving.

2.10. Імуногістохімія тканин грудної аорти

До імуногістохімічного фарбування зрізи тканин у парафіні встановлювали на предметних стеклах, покритих полілілізином (Fisher Scientific, Пітсбург, Пенсільванія, США). Тканини на кожному предметному склі були імуно забарвлені за допомогою наборів Invitrogen HISOTO-STAIN-SP із позначеним методом стрептавідин-біотин (LAB-SA). Після отримання антигену предметні стекла занурювали в 3% перекис водню на 10 хв при кімнатній температурі, щоб блокувати активність ендогенної пероксидази, і промивали PBS. Далі предметні стекла інкубували з 10% неімунною козячою сироваткою протягом 10 хв при кімнатній температурі та інкубували з первинними антитілами проти ICAM-1, VCAM-1, ET-1 та eNOS (1: 200; Санта-Крус, Каліфорнія, США) у зволожені камери протягом ночі при 4 ° C. Далі предметні стекла інкубували з біотинільованими вторинними антитілами протягом 20 хв при кімнатній температурі з наступною інкубацією з кон’югованим з пероксидазою хрону стрептавідином хрону протягом 20 хв при кімнатній температурі. Активність пероксидази візуалізували за допомогою 3,3′-діамінобензидину (DAB; Novex, Каліфорнія) субстратно-хромогенної системи з гематоксиліновим протибарвленням (Zymed, CA, USA). Для кількісного аналізу середній бал 10–20 випадково вибраних областей розраховували за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень NIH, ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).

2.11. Статистичний аналіз

Таблиця 1

Вплив БЦ на масу тіла, масу печінки, масу печінки,% від маси тіла, масу епідидимальних жирових накладок та масу епідидимальних жирових накладок,% від ваги.

Продовження HFBC1BC2

Вага тіла (г)
Почніть	227,62 ± 1,96	221,75 ± 2,64	233,79 ± 1,99	224,27 ± 2,31
Остаточний	466,15 ± 10,75	455,14 ± 8,15	427,14 ± 10,97 #	419,73 ± 6,6 #
Вага печінки (г)	10,9 ± 0,52	13,2 ± 0,76 ∗	11,18 ± 0,21 #	10,8 ± 0,23 ##
Вага печінки,% від БВ	2,49 ± 0,07	2,8 ± 0,03 ∗	2,52 ± 0,03 #	2,54 ± 0,04 #
Епідидимальні жирові прокладки важать (г)	6,64 ± 0,4	7,47 ± 0,46 ∗	6,42 ± 0,55 #	5,15 ± 0,42 #
Епідидимальні жирові прокладки,% від маси тіла	1,45 ± 0,05	1,74 ± 0,06 ∗	1,38 ± 0,14 #	1,19 ± 0,08 #

Таблиця 2

Вплив BC на CRP, T-Bil, лептин та інсулін.