Звернення до молекулярного механізму поздовжнього ламінового складання з використанням химерних розплавів

(a) Схематичне зображення первинної структури ламіна A. C1A, coil1A; L1, лінкер 1; C1B, котушка1B; L12, лінкер 2; С2, котушка2; NLS, сигнал локалізації ядерної енергії; Ig-подібний, імуноглобуліноподібний домен. Химерні фрагменти, використані тут для кристалографічних досліджень, наведені нижче. Мотиви Eb1 та Gp7F40C, що укупорюють, мають кольори блакитного та пшеничного відповідно. (b) Схема поздовжнього складання пластин, яка базується на взаємодії ACN.

(а) Кристалічна структура Gp7F40C-LA 327-403. Область LA 327-403 та ковпачок Gp7F40C пофарбовані у світло-блакитний та пшеничний відповідно. Атоми сірки, що використовуються для визначення структури, мають пофарбований оранжевий (цистеїн) та жовтий (метіонін). Додатковий зв’язаний іон важкого атома (Ni) забарвлений у темно-синій колір. (b) Суперпозиція структури Gp7F40C-LA 327-403 із залишками 327–386 структури LA 305-387 (код PDB 1X8Y, фіолетовий) у двох перпендикулярних видах. Заїкання (залишки 327–330) позначено червоними стрілками.

(а) Кристалічна структура LA 17-70-Eb1. Залишки головки, котушка 1A та перші три залишки лінкера L1 пофарбовані сірим, блідо-зеленим та жовтим відповідно. Ковпачок Eb1 забарвлений у блідо-блакитний колір. Дві молекули води, які беруть участь у містках зв’язку H на α-гвинтовій перегині, показані червоними сферами. Бічні ланцюги залишків у положеннях «а» (кольорова чорна) та «d» (кольорова оливкова), починаючи з Leu35, тобто залишки, що утворюють гідрофобне ядро СС, відображаються у вигляді паличок. (b) Вид зверху N-кінцевого кінця димеру з антипаралельним β-замком, стабілізованим двома Н-зв’язками (блакитними пунктирними лініями) між залишками Ile26. Показано H-зв'язок між киснем бічного ланцюга Thr27 та азотом основного ланцюга Gln30 (жовта пунктирна лінія). (c) Наблизьте α-гвинтовий злам, присутній у ланцюзі А. Відображено регулярний шаблон водневого зв’язку основного ланцюга, а також два мости, що з’єднують H-з'єднання на водній основі (жовті пунктирні лінії). Неоптимальне кутове положення Н-зв'язку між киснем основного ланцюга залишку Lys32 та азотом залишку Gln36 показано у вигляді фіолетової штрихової лінії.

Кристалічна структура димеру LA 1-70-Eb1 з котушкою1A зеленим, область L1 жовтим і кришкою Eb1 блакитним. Окрім того, кристал для симетрії кристалів показаний чорним (ламінова частина) та сірим (кришка Eb1). Збільшена область ілюструє взаємодії, відповідальні за антипаралельне перекриття N-кінцевих частин. Показані бічні ланцюги, що утворюють загальне гідрофобне ядро (кольорове золото), а також залишки Glu37 та Arg41, що утворюють сольові містки (кольорові світло-сірі).

Аналіз розкриття димеру котушки 1А в різних структурах (коди PDB наведені в дужках). (а) Суперпозиція сегментів котушки 1A, видно в LA 17-70-Eb1 (зелений), LA 1-70-Eb1 (золото) та фрагмент віментину 102-138 з мутацією Y117L (рожевий; код PDB 3G1E [30]). Залишки в положеннях «а» та «d», що утворюють гідрофобне ядро, показані у вигляді паличок. (b) радіус CC, побудований як функція від залишкового числа (відповідно до послідовності LA) для областей coil1A у трьох структурах, як визначено за допомогою TWISTER [58].

(a) Аналіз SEC-MALS комплексу LA 17-70-Eb1/Gp7F40C-LA 327-403 (співвідношення 1: 1), LA 22-70-Eb1 та комплексу Gp7F40C-LA 327-403 (співвідношення 1: 1), конструкція Gp7F40C-LA 327-403 та конструкція LA 17-70-Eb1. Комплекс LA 17-70-Eb1/Gp7F40C-LA 327-403 та обидві окремі конструкції працювали в 150 мМ NaCl, 10 мМ Hepes (pH 7,5) буфері. Другий комплекс пропускали в 150 мМ NaCl, 10 мМ TEA (рН 7) буфері. Суцільні лінії показують нормовані профілі показника заломлення. Штрихові лінії показують значення молекулярної маси на основі MALS на піках. (b) SDS-PAGE хроматографічних фракцій, що відповідають основному піку комплексу LA 17-70-Eb1/Gp7F40C-LA 327-403 у (а). Сині та зелені стрілки позначають Gp7F40C-LA 327-403 та LA 17-70-Eb1 відповідно.

Зменшення аналізу SDS-PAGE LA 22-70-Eb1, Gp7F40C-LA 327-403 та очищеного від SEC комплексу цих двох фрагментів без зшивання (без XL) та після зшивання з DSG, DSBU та EDC. Найімовірніша стехіометрія різних смуг дана праворуч від кожного гелю, де літери N і C позначають N- і С-кінцеві фрагменти відповідно. Теоретичні маси всіх смуг наведені на бічній панелі.

Моделювання тетрамеру ACN. (а) Кінцева молекулярна модель тетрамеру ACN. Gp7F40C-LA 327-403 - це кольорова пшениця (Gp7F40C) та синя (LA 327-403). LA 17-70-Eb1 забарвлений у зелений/жовтий (LA 17-70) та блакитний (Eb1). (b) Кінцева молекулярна модель тетрамеру ACN з усіма 31 поперечними зв’язками, сумісними з моделлю. Інтердимерні зшивки пофарбовані зеленим кольором. Поперечні зв’язки тетрамерів маркуються і пофарбовані в червоний колір (DSBU, DSPU та DSG) та пурпуровий (EDC). (c) Поворотний вигляд моделі з залишками гідрофобних ядер, показаними у вигляді паличок (позиції „a“ та „d“ у чорному та оливковому відповідно).

Анотація

(а) Кристалічна структура Gp7F40C-LA 327-403. Область LA 327-403 та ковпачок Gp7F40C пофарбовані у світло-блакитний та пшеничний відповідно. Атоми сірки, що використовуються для визначення структури, пофарбовані в оранжевий (цистеїн) і жовтий (метіонін). Додатковий зв’язаний іон важкого атома (Ni) забарвлений у темно-синій колір. (b) Суперпозиція структури Gp7F40C-LA 327-403 із залишками 327–386 структури LA 305-387 (код PDB 1X8Y, фіолетовий) у двох перпендикулярних видах. Заїкання (залишки 327–330) позначено червоними стрілками.

(а) Кристалічна структура LA 17-70-Eb1. Залишки головки, котушка 1A та перші три залишки лінкера L1 пофарбовані сірим, блідо-зеленим та жовтим відповідно. Ковпачок Eb1 забарвлений у блідо-блакитний колір. Дві молекули води, які беруть участь у містках зв’язку H на α-гвинтовій перегині, показані червоними сферами. Бічні ланцюги залишків у положеннях «а» (кольорова чорна) та «d» (кольорова оливкова), починаючи з Leu35, тобто залишки, що утворюють гідрофобне ядро СС, відображаються у вигляді паличок. (b) Вид зверху N-кінцевого кінця димеру з антипаралельним β-замком, стабілізованим двома Н-зв’язками (блакитними пунктирними лініями) між залишками Ile26. Показано H-зв'язок між киснем бічного ланцюга Thr27 та азотом головного ланцюга Gln30 (жовта пунктирна лінія). (c) Наблизьте α-гвинтовий злам, присутній у ланцюзі A. Показані регулярні схеми водневого зв’язку основного ланцюга, а також два мости, що з’єднують Н на водній основі (жовті штрихові лінії). Неоптимальне кутове положення Н-зв'язку між киснем основного ланцюга залишку Lys32 та азотом залишку Gln36 показано у вигляді фіолетової штрихової лінії.

Кристалічна структура димеру LA 1-70-Eb1 з котушкою1A зеленим, область L1 жовтим і кришкою Eb1 блакитним. Крім того, кристал для симетрії кристалів показаний чорним (ламінова частина) та сірим (кришка Eb1). Збільшена область ілюструє взаємодії, відповідальні за антипаралельне перекриття N-кінцевих частин. Показані бічні ланцюги, що утворюють загальне гідрофобне ядро (кольорове золото), а також залишки Glu37 та Arg41, що утворюють сольові містки (кольорові світло-сірі).

(a) Аналіз SEC-MALS комплексу LA 17-70-Eb1/Gp7F40C-LA 327-403 (співвідношення 1: 1), LA 22-70-Eb1 та комплексу Gp7F40C-LA 327-403 (співвідношення 1: 1), конструкція Gp7F40C-LA 327-403 та конструкція LA 17-70-Eb1. Комплекс LA 17-70-Eb1/Gp7F40C-LA 327-403 та обидві окремі конструкції працювали в 150 мМ NaCl, 10 мМ Hepes (pH 7,5) буфері. Другий комплекс пропускали в 150 мМ NaCl, 10 мМ TEA (рН 7) буфері. Суцільні лінії показують нормовані профілі показника заломлення. Штрихові лінії показують значення молекулярної маси на основі MALS на піках. (b) SDS-PAGE хроматографічних фракцій, що відповідає основному піку комплексу LA 17-70-Eb1/Gp7F40C-LA 327-403 у (а). Сині та зелені стрілки позначають Gp7F40C-LA 327-403 та LA 17-70-Eb1 відповідно.