Антагоніст гормону росту гормону росту MZ-5-156 інгібує ріст DU-145 андроген-незалежної карциноми простати людини у оголених мишей і пригнічує рівні та експресію мРНК інсуліноподібного фактора росту II в пухлинах

Внесок Ендрю В. Шаллі

Анотація

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Пептид та реагенти.

Антагоніст GH-RH (MZ-5-156) PhAc- [D-Arg 2, Phe (p-Cl) 6, Abu 15, Nle 27] hGH-RH (1–28) Agm [де PhAc - це фенілацетил, Phe ( p-Cl) - парахлор-фенілаланіл, Abu - α-аміноізобутирил, Nle - норлейцил, а Agm - агматин] синтезований твердофазними методами та очищений у нашій лабораторії (20). Для щоденних ін’єкцій MZ-5-156 розчиняли в 0,1% диметилсульфоксиді (DMSO) у стерильному 10% розчині пропіленгліколь/сольовий розчин (Sigma).

Тварини.

Оголених мишей атимічного типу (Ncr nu/nu), віком приблизно 6 тижнів після прибуття, взяли з Національного інституту раку (Бетесда, штат Меріленд) і розмістили в шарах ламінарного потоку повітря в умовах без патогенів при 12-годинному освітленні h темний графік і подається в автоклаві стандартна чау і вода за бажанням. Догляд за ними відповідав інституційним правилам.

Культура клітин.

Лінія раку передміхурової залози DU-145, яка не залежить від андрогену, була отримана з американської колекції типів культур (ATCC, Манассас, штат Вірджинія). Клітини DU-145 вирощували як моношар у середовищі RPMI 1640 (GIBCO), доповненому 10% фетальною бичачою сироваткою, антибіотиками та антимікотиками при температурі 37 ° C у зволоженому атмосфері 95% повітря/5% CO2. Клітини пухлини, що ростуть експоненціально, збирали шляхом короткої інкубації з 0,25% розчином трипсину-ЕДТА (GIBCO). Ксенотрансплантати DU-145 були ініційовані s.c. ін'єкція 1 × 10 7 клітин у ліві боки п’яти голих мишей-самців.

Експериментальний протокол.

Пухлини DU-145, отримані через 8 тижнів росту, були асептично розсічені та механічно подрібнені; 3-міліметрові 3 шматочки кожної пухлинної тканини пересаджували s.c. голкою троакара у самців оголених мишей під наркозом метоксифлуран (Метофан, Пітман – Мур, Манделейн, Іллінойс). Через шість тижнів після трансплантації, коли пухлини виросли до об'єму від 40 до 50 мм 3, мишей, що несуть пухлину, розділили на дві групи по вісім тварин у кожній. Контрольній групі вводили лише 0,1% ДМСО у 10% пропіленгліколь/сольовий розчин. (розчин носія), а експериментальну групу обробляли 20 мкг антагоніста GH-RH MZ-5-156 с. с. два рази на день. Лікування продовжували протягом 8 тижнів. Пухлини вимірювали один раз на тиждень мікрокаліперами, і обсяг пухлини обчислювали як довжину × ширину × висоту × 0,5236 (25). В кінці експерименту мишам знеболювали метоксифлюраном і жертвували декапітацією, а також збирали кров стовбура. Сироватку відокремлювали та аналізували радіоімуноаналізом. Реєстрували масу тіла, пухлини ретельно розтинали, очищали та зважували, а зразки кожної пухлини відбирали для радіоімунологічного та молекулярно-біологічного аналізів.

Радіоіммоноаналіз на IGF-I та IGF-II.

Вилучення РНК.

Загальну РНК виділяли з людських пухлин DU-145 за допомогою RNAzolJ B (Tel-Test, Friendswood, TX) згідно з інструкціями виробника. Гранули РНК суспендували в 50 мкл 10 мМ трис/1 мМ буфера EDTA (рН 8,0) і кількісно визначали спектрофотометрично при 260 нм.

Зворотна транскрипція – ПЛР (RT-PCR).

Олігонуклеотидні праймери, що використовуються в аналізі RT-PCR для експресії мРНК IGF-I, IGF-II та β-актину людини в андроген-незалежних пухлинах простати людини DU-145

Аналіз південного плями.

Після електрофорезу гель обробляли денатураційним буфером, потім за допомогою буфера нейтралізації продукти ПЛР переносили в мембрану Hybond N + шляхом капілярного перенесення, і кДНК приєднували до нього нагріванням протягом 2 годин при 80 ° C. Прегібридизацію здійснювали при 37 ° C протягом 4 годин у буфері, що містив 50% формаміду, 1 М NaCl, 1% SDS та 100 мкг/мл денатурованої та ультразвукової ДНК лосося. Потім мембрану гібридизували в буфері передгібридизації, що містив людську 32-мічену кДНК IGF-II з IGF-II (1 kbp) або 32-мічену β-актинову кДНК (1,1 kbp). Обидві кДНК були придбані в АТСС і марковані за допомогою багатопрофільної системи маркування (Amersham). Плямки промивали в жорстких умовах, а сигнали з зразків сканували та кількісно визначали за допомогою денситометра зображення (модель GS-700, Bio-Rad).

секвенування кДНК.

Продукт ПЛР, отриманий після RT-PCR-аналізу з використанням специфічних праймерів для IGF-II, секвенували за допомогою модифікованих протоколів хімії ABI Big Dye Terminator (Genome Systems, Сент-Луїс). Зразок кДНК аналізував Б. Блейкі, використовуючи секвенсор ДНК ABM Prism 337 у Genome Systems.

Статистичний аналіз.

Усі значення виражаються як середнє значення ± SEM, а статистичний аналіз проводився за допомогою тесту Данкана з кількома діапазонами.

РЕЗУЛЬТАТИ

Вплив антагоніста GH-RH MZ-5-156 на ріст пухлин DU-145.

Об'єм пухлини у мишей-тимусів, які підшкірно трансплантували DU-145 андроген-незалежний рак простати людини після лікування антагоністом GH-RH MZ-5-156, введеним s.c. у дозі 20 мкг на тварину двічі на день (два рази). Лікування розпочали, коли пухлини мали розміри приблизно 40-50 мм 3 і тривали протягом 8 тижнів. Вертикальні лінії позначають SEM. ∗, P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Рівні IGF-I та IGF-II у сироватці та пухлинній тканині оголених мишей, що несуть андроген-незалежні ксенотрансплантати простати DU-145 в кінці періоду лікування антагоністом GH-RH MZ-5-156

Вплив MZ-5-156 на експресію мРНК IGF-II у пухлинах DU-145.

RT-PCR-аналіз експресії мРНК IGF-II (a) та β-актину (b) у пухлинах простати DU-145. Продукти ПЛР відокремлювали за допомогою електрофорезу в 1,8% агарозному гелі та фарбували бромідом етидію. Розміри очікуваних продуктів ПЛР становили 538 та 518 п.н. для hIGF-II та hβ-актину відповідно. Доріжки: M (маркер молекулярної маси), MX174 HaeIII дайджест; 1, негативний контроль; 2–6, зразки необроблених тварин; 7–11, зразки пухлини у тварин, які отримували антагоніст GH-RH MZ-5-156.

Саузерн-блот-аналіз кДНК для IGF-II (a) та β-актину (b) людини, отриманих після RT-PCR. Продукти ПЛР відокремлювали за допомогою електрофорезу в 1,8% агарозному гелі і переносили в мембрани Hybond N +. Гібридизацію проводили із зондами кДНК, специфічними для hIGF-II або hβ-актину. Плямки промивали в жорстких умовах і піддавали аудіорадіографії. Нумерація така ж, як на рис. 2.

Вплив антагоніста GH-RH MZ-5-156 на експресію мРНК для IGF-II при DU-145 андрогеннезалежних ракових захворюваннях простати людини. Після денситометрії рівні мРНК для hIGF-II стандартизували відповідно до рівнів мРНК hβ-актину і виражали у відсотках до контрольного значення. ∗∗, P ‡ Кому слід звертатись із запитами на передрук: Медичний центр у справах ветеранів, 1601 Perdido Street, Новий Орлеан, LA 70146.

↵ § У відпустці з кафедри анатомії людини Університетської медичної школи м. Печ, Печ, Угорщина.