Книжкова полиця

Книжкова полиця NCBI. Служба Національної медичної бібліотеки, Національних інститутів охорони здоров’я.

гемоглобіну

Old J, Harteveld CL, Traeger-Synodinos J, et al. Профілактика таласемій та інших порушень гемоглобіну: Том 2: Лабораторні протоколи [Інтернет]. 2-е видання. Нікосія (Кіпр): Міжнародна федерація Таласемії; 2012 рік.

Профілактика таласемій та інших порушень гемоглобіну: Том 2: Лабораторні протоколи [Інтернет]. 2-е видання.

3.1. ХРОМАТОГРАФІЧНІ МЕТОДИ (ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ HbA2)

Кількісне визначення HbA2 є найціннішим тестом для ідентифікації носія β-таласемії. Було створено декілька методів, але зараз рекомендується лише декілька для їх точності. Слід зазначити, що точність та точність визначення HbA2 за допомогою денситометрічного сканування після електрофорезу целюлози в ацетаті є незадовільним, і його використання слід уникати (1). Ізоелектричне фокусування (IEF) має чудову роздільну здатність, що дозволяє точно визначити кількість, але це громіздко і трудомістко. Капілярний електрофорез (СЕ) все частіше використовується в клінічній діагностиці для діагностики гемоглобінопатій. Кілька досліджень показали чудову кореляцію між капілярним електрофорезом та високоефективною катіонообмінною хроматографією (ВЕРХ) для якісного та кількісного аналізу гемоглобіну (2-4).

Найбільш використовуваними методами вимірювання HbA2 є СЕ, ВЕРХ і рідше мікрохроматографія на DE-52 (5-8). Ці методи дуже точні, швидкі та прості. Крім того, CE та HPLC ідентифікують та вимірюють багато варіантних гемоглобінів, включаючи часто зустрічаються варіанти HbS, HbC, HbE та Hb D-Пенджаб. На рисунку 3.1 показані приклади хроматограмм ВЕРХ з 4 різних аналізаторів (Варіант II, HA 8160, G7 та Ultra 2) у порівнянні з CE.

Фіг. 3.1

Приклади хроматограм ВЕРХ у порівнянні з CE (адаптовано з Van Delft et al., 2009, посилання 4). Зліва направо: Капіляри CE, Варіант II, HA 8160, G7 та Ultra 2. a = нормальний; b = HbA/S; c = HbA/C; d = HbA/E; e = HbA/D; f = Високий HbA2 Гетерозиготна β-таласемія. (більше.)

3.1.1. ВЕРХ для скринінгу гемоглобінопатій

Катіон: обмінна високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) стала методом вибору для кількісного визначення HbA2, HbF та для виявлення та кількісного визначення варіантів Hb, особливо тих, які можуть взаємодіяти з β-таласемією, такими як HbS, E, C, O -Араб, D і Лепоре.

Принцип: У цьому способі фосфатні буфери при різних концентраціях (рухома фаза) проходять під тиском через іонообмінну колону (нерухома фаза). Стаціонарна фаза складається з аналітичного картриджа з регульованою температурою, що містить смолу аніонних або катіонних частинок (3-5 мкм). Хроматографічна станція подає запрограмований буферний градієнт збільшення іонної сили та рН до картриджа двома двопоршневими насосами, а гемоглобіни розділяються відповідно до їх іонної взаємодії зі стаціонарною фазою.

Потім відокремлені гемоглобіни проходять через проточну комірку фільтруючого фотометра, де вимірюють зміни поглинання (415 нм); фонові зміни коригуються додатковим фільтром при 690 нм. Кожен гемоглобін характеризується певним часом утримання, тобто часом, що минув від введення зразка до вершини піку гемоглобіну.

Коефіцієнти калібрування для HbA2, F, A1C автоматично обчислюються шляхом обробки калібрувальної проби на початку кожного циклу. Спеціальне програмне забезпечення перетворює вихідні дані, зібрані з кожного аналізу, у звіт, що показує хроматограму, з усіма елюйованими фракціями гемоглобіну, часом утримування, площами піків та значеннями (%) різних компонентів гемоглобіну. У звіті представлені відсотки гемоглобінів F, A1C, A та A2 та пропонується якісне та кількісне визначення аномальних гемоглобінів.

Зразок: Венозна кров у будь-якому антикоагулянті.

Метод: Загальновживаним апаратом є Variant (Bio-Rad Laboratories). Однак нещодавно надійні результати були отримані і з іншими інструментами, такими як HA816 (Menarini Arkay) та G7 (Tosoh- Bioscience) (4).

Результати та інтерпретація: Очікуваний нормальний діапазон для HbA2 становить від 1,7% до 3,2% у нормальних суб'єктів, тоді як у носіїв β-таласемії, коли він становить від 4,0% до 7%. Значення HbA2 вважаються граничними, коли вони складають від 3,2% до 3,8%. Зразки з цими рівнями потребують подальшого дослідження на предмет можливої ​​нормальної таласемії HbA2 (див. Таблицю 1.1). Нормальний діапазон HbF зазвичай становить менше 1,5% загального гемоглобіну.

Машини HPLC мають вікна ідентифікації аналіту, які допомагають інтерпретувати нормальні та аномальні гемоглобіни, виявлені у зразку крові (9). Вікна - це визначені інтервали часу утримання, в яких елююються загальні варіанти гемоглобіну (наприклад, HbS, C і D). Однак слід зазначити, що оскільки інші варіанти Hb можуть мати подібний час утримування до загальних варіантів (таблиці 3.1a та 3.1b), ідентифікація варіанту Hb є лише передбачуваною (рис. 3.1) та аналіз амінокислот ДНК або глобіну необхідний для остаточної ідентифікації варіанту Hb (10). ВЕРХ також використовується для скринінгових програм гемоглобінопатії новонароджених (11).

Таблиця 3.1а

Час елюції деяких варіантів гемоглобіну, що спостерігається у системі ВЕРХ BioRad Variant-II.

Таблиця 3.1 b

(частина 1) Зони елюції деяких варіантів гемоглобіну, що спостерігаються в системі капілярного електрофорезу Sebia Capillarys: Зони 1-7.