Залишайтеся худими, не дотримуючись дієт

Марк-Етьєн Уот

1 Центр досліджень раку університету Лаваля; Hôtel-Dieu de Québec; CHUQ; Квебек, Квебек, Канада

Стефан Річард

2 Молекулярна онкологічна група Террі Фокса та Центр досліджень старіння Блумфілд; Інститут медичних досліджень леді Девіс та відділення онкології та медицини; Університет Макгілла; Монреаль, КК, Канада

Анотація

Добре відомо, що альтернативне зрощування є тканин-специфічним. Хоча було показано, що кілька генів зазнають альтернативного сплайсингу в адипоцитах, мало відомо про механізм, який регулює альтернативне сплайсинг під час адипогенезу. Нещодавно ми повідомляли, що миші Sam68 -/- мають худий фенотип і захищені від ожиріння, спричиненого дієтою. Наш аналіз масиву екзонів у білій жировій тканині (WAT) мишей дикого типу та Sam68 -/- виявив, що дефіцит Sam68 призводить до аномального сплайсингу гена mTOR. Показано, що це зменшує загальний вміст і активність білка mTOR під час диференціації жирової тканини in vitro. У мишей Sam68 -/- така ситуація призводить до збільшення витрат енергії, зниження адипогенезу та утворення ВАТ.

Вступ

Доступність дефіцитних Sam68 мишей призвела до виявлення деяких фізіологічних ролей цього РНК-зв’язуючого білка типу KH. Миші Sam68 -/- не виявляють явного фенотипу, однак самці мишей безплідні через дефект сперматогенезу, тоді як самки знижують фертильність через дефекти належної експресії транскриптів рецепторів гонадотропіну в фолікулах до овуляції у дорослих яєчниках. 15 - 18 Більше того, миші Sam68 -/- захищені від вікового остеопорозу. 16 Дійсно, було показано, що миші Sam68 -/- у віці зберігають щільність кісткової тканини завдяки залежності від Sam68 стимулювання диференціації остеобластів і таким чином захищаються від вікової втрати кісткової тканини. 16 Ці результати свідчать про те, що Sam68 бере безпосередню участь у диференціації мезенхімальних стовбурових клітин. Втрата експресії Sam68 зміщує диференціацію мезенхімальних стовбурових клітин у бік остеогенного лінії, замість адипоцитарного. Це підтвердила наша недавня демонстрація того, що миші з дефіцитом Sam68 є худими та захищеними від ожиріння, спричиненого дієтою. 5

Sam68 та Adipogenesis

mTOR сплайсинг

Використовуючи широкомасштабний експресійний масив екзонів, ми виявили, що втрата Sam68 впливає на сплайсинг великої кількості генів у білій жировій тканині. Ми показали, що на сплайсинг гена mTOR значний вплив мають рівні Sam68. mTOR належить до сімейства білків, пов'язаних з фосфатидилінозитол-3-кіназою, і, як відомо, регулює ключові клітинні процеси, такі як розмір клітини, проліферація клітин, рухливість клітин та виживання клітин. 19 mTOR - це каталітична субодиниця, що міститься у двох різних комплексах (mTORC1 та mTORC2). 20 mTORC1 характеризується своєю асоціацією з білком Raptor та чутливістю до рапаміцину, тоді як mTORC2 характеризується наявністю білка Rictor та його стійкістю до рапаміцину. 19 Відомо, що інгібування mTORC1 запобігає адипогенній диференціації попередніх адипоцитів, 21, 22 та знижує регулювання відкладення жиру у гризунів. 23, 24 Більше того, пригнічення передачі сигналів mTORC1 у мишей призводить до худих фенотипів. 25 - 27

З вищезазначених причин ми вирішили більш детально дослідити залежне від Sam68 сплайсинг mTOR. 5 Ми виявили, що втрата Sam68 активує використання інтронного сигналу поліаденілювання в інтроні 5 гена mTOR. Ця нова ізоформа, яку ми позначаємо як mTORi5, включає екзони від 1 до 5 плюс проникнення інтрону 5, тим самим генеруючи

1 кб мРНК (рис. 1А). Ми показали, що Sam68 асоціюється з двома короткими послідовностями UUUUA в межах інтрону 5. Мутації в кожному з двох елементів UUUUA послідовностей впливають на зв'язування Sam68 і призводять до підвищення рівня білка mTORi5 білка.

Фігура 1. Схематичне зображення функції Sam68 під час адипогенезу. (A) Вплив Sam68 на сплайсинг мРНК mTOR. Інактивація Sam68 або погіршення його зв'язування зі специфічними елементами, присутніми в mTOR intron 5, збільшує зчитування та включення intron 5, тим самим активуючи сигнал інтронного поліаденілювання. Це призводить до нового варіанту мРНК mTOR, переклад якого передбачає синтез усіченої версії mTOR, що називається mTORi5. (B) Інактивація Sam68 блокує прогресування адипогенезу на рівні преадипоцитів через зменшення пулу білка mTOR у повній довжині, що призводить до відсутності активації mTORC1/2.

mTORi5

Використовуючи qRT-PCR, ми спостерігали, що мТОР mTORi5 є в клітинах 3T3-L1 із дефіцитом Sam68, але відсутня в контрольних клітинах 3T3-L1. Оскільки mTOR intron 5 містить внутрішній кадр передчасного термінального кодону, а також сигнал поліаденилювання, подія утримання інтрону, як очікується, призведе до білка mTOR з

25 кДа з великим відсіканням С-кінця. Білок, який, як передбачається, буде експресований з мРНК mTORi5, міститиме більшість N-кінцевих доменів HEAT, типу білково-білкового домену взаємодії, знайденого в ряді цитоплазматичних білків. 28 Це привело нас до думки, що білок mTORi5 може виявляти домінантно-негативну поведінку через його зв'язування з компонентом комплексів mTORC1/2, утворюючи, таким чином, каталітично неактивний комплекс. Щоб оцінити цю можливість, ми ввели вектор, який експресує FLAG-мічений білок mTORi5 у клітинах HeLa. Потім ми контролювали активність комплексів mTORC1/2, використовуючи фосфоспецифічні антитіла до рибосомного білка S6 (для виявлення активності mTORC1) та фосфоспецифічні антитіла AKT (для оцінки активності mTORC2). Хоча

Білок FLAG-mTORi5 25 кДа ефективно експресувався в цих клітинах; ми виявили, що він практично не впливав на рівень фосфорилювання білка S6 S240/S244 або AKT S473 після стимуляції інсуліном. Більше того, ми не змогли виявити білок mTORi5 у клітинах, у яких експресія Sam68 була скасована за допомогою N-кінцевих специфічних комерційних антитіл, які розпізнавали ектопічну експресію FLAG-mTORi5. Ці результати дозволили нам виключити будь-яку домінантно-негативну функцію для білка mTORi5 і припустили, що мРНК або білок mTORi5 можуть швидко руйнуватися за допомогою ще невстановленого механізму.

Sam68 регулює діяльність mTOR

Одним з основних ефектів утворення ізоформи mTORi5 є зниження рівня мРНК mTOR та білка. Оскільки mTORC1 є важливим для нормального адипогенезу, і оскільки виснаження основного компонента комплексу, а саме mTOR, впливає на диференціювання перед адипоцитами, дефіцит експресії Sam68 призводить до зменшення активності mTORC1. Загальний ефект зниженої активності mTORC1 - це пригнічення диференціювання перед адипоцитами (рис. 1В). Цікаво, що нам вдалося випередити останній фенотип, повторно впровадивши mTOR у повнорозмірних клітинах з дефіцитом Sam68 3T3-L1. Останній результат вказує на те, що Sam68 робить свій внесок у адіпогенез, забезпечуючи належне сплайсинг інтрону 5 в процесі синтезу мРНК mTOR, дозволяючи таким чином експресію mTOR повної довжини.

Висновок

Наша робота свідчить про те, що Sam68 є ключовим регулятором альтернативного зрощування білої жирової тканини. Наші результати пропонують нові терапевтичні можливості для блокування адипогенезу та ожиріння, спричиненого дієтою, що може запобігти довгостроковим ускладненням, пов’язаним з ожирінням, спричиненим дієтою, однією з провідних причин смерті у Північній Америці.