Процес відновлення тирозолу та гідрокситирозолю з стічних вод олійниці та спосіб каталітичного окислення з метою перетворення тирозолу в гідрокситирозоль

A для приготування тирозолу та/або гідрокситирозолу з стічних вод олійниць. включає: а) мікрофільтрацію (MF), ультрафільтрацію (UF), нанофільтрацію (NF) та зворотний осмос (RO) OMW; б) Відділення тирозолу, гідрокситирозолу та інших фенольних сполук від концентрованої RO; в) Окислення отриманого тирозолу до гідрокситирозолу в присутності триоксиду метилренію та пероксиду водню в протонному розчиннику.

Даний винахід стосується процесу відновлення тирозолу та гідрокситирозолю з стічних вод олійниці та способу каталітичного окислення тирозолу до гідрокситирозолю.

ПІДСУМКИ ВИНАХОДУ

Проблема стічних вод олійниці добре відома. Віджимання оливок у країнах, що виробляють олію, створює як побічний продукт із розрахунку 40/50% від маси пресованих оливок стічні води олійниць, багаті на сильно забруднюючі органічні сполуки (поліфеноли), які створюють ряд екологічних та екологічних проблеми, пов'язані з їх усуненням та лікуванням.

Для усунення такого роду проблем було запропоновано багато методів, наприклад, методом фотокаталізу, озонування тощо, але на сьогоднішній день ще не існує жодного задовільного рішення, зокрема рішення, яке не передбачає різкого скорочення виробництва при сильному зростанні цін.

З іншого боку, відомо, що стічні води олійниці містять метаболіти, що представляють інтерес для косметичної, фармацевтичної, дієтичної та харчової промисловості. Отже, виділення цих метаболітів, особливо тирозолу та гідрокситирозолю, із стічних вод олійниць є метою особливого прикладного інтересу завдяки їх антиоксидантним властивостям.

Наприклад, WO 2004/005228 описує процес екстракції гідрокситирозолю, що включає підкислення стічних вод олійниці з наступною екстракцією органічними розчинниками та надкритичними рідинами.

ОПИС ВИНАХОДУ

В даний час було знайдено процес очищення стічних вод нафтопереробного заводу (ОМВ), що дозволяє, з одного боку, проводити детоксикацію ОМВ з відновленням води до 85% для добре политого та цивільного використання, як це прийнято законодавством та, з іншого боку, відновлення високочистого тирозолу та гідрокситирозолу.

Крім того, даний винахід забезпечує процес подальшого каталітичного окислення тирозолу в гідрокситирозоль.

Цей процес дозволяє відновити кожен компонент вихідної рідини, повторно використовувати та використовувати кожен окремий розділений компонент.

Процес винаходу легко промислово застосовний без додаткових витрат, що впливають на ціну продажу оливкової олії, і дає можливість продавати продукти на основі гідрокситирозолю, які можна використовувати для здоров'я людини (ліки), для охорони здоров'я (інтегратори, нутрицевтики, косметика) та для харчової промисловості.

Процес винаходу включає:

- Груба фільтрація (RF), мікрофільтрація (MF), ультрафільтрація (UF), нанофільтрація (NF) та зворотний осмос (RO) OMW;
- Хроматографічне відділення тирозолу, гідрокситирозолю та інших фенольних сполук від концентрованої RO;
- Окислення отриманого тирозолу до гідрокситирозолу у присутності триоксиду метилренію та пероксиду водню в протонному розчиннику;
- Концентрація та подрібнення високомолекулярної частини з вилученням води та сполук з високою доданою вартістю.

Послідовні етапи грубої фільтрації, мікрофільтрації, ультрафільтрації, нанофільтрації та зворотного осмосу, схематизовані на фіг. 1, що стосується зазначених інтервалів молекулярних розмірів, дозволяють відновити після концентрації щонайменше 1 г/л гідрокситирозолу та 0,6 г/л тирозолу.

Потім ці компоненти можна виділити з чистотою вище 98% хроматографією в інвертованій фазі на підготовчій колонці.

Підготовчу колону бажано заповнювати макропористим співполімером дивінілбензолу та N-вінілпіролідону. Цей співполімер завдяки полярній функціональній групі здатний утримувати полярні молекули. Використання колон, заповнених цим співполімером, дозволяє виділити компоненти (тирозол, гідрокситирозоль, тригідроксибензойна кислота, катехол та ін.), Що містяться в суміші, і, зокрема, приготувати гідрокситирозоль з високим рівнем чистоти без катехолу (орто -дифенол, що міститься в ОМВ і токсичний для людини).

Співвідношення концентрацій (їжа/екстракт) на стадіях мікрофільтрації, ультрафільтрації, нанофільтрації та зворотного осмосу переважно перевищує 8.

Процес винаходу дозволяє відновити щонайменше 70% обсягу води відносно початкового загального обсягу ОМВ, з такою якістю, яку можна утримувати в межах, визначених чинними законами щодо можливого сільськогосподарського/цивільного використання ( нижче 100 мг O2/л ХПК). Переважно стадії ультрафільтрації, нанофільтрації та зворотного осмосу проводять при нейтральному або лужному рН.

Подальша обробка випаровування/конденсації концентратів на різних стадіях фільтрації дозволяє додатково відновити приблизно 15%, загалом до 85% відновлення води.

Фракція органічного матеріалу, вилучена з попередніх стадій мембрани до перевернутого осмосу, складається з поліфенольних сполук, розподілених у різних класах молекулярної маси.

Поліфеноли, отримані цим способом, можуть бути використані для косметичних та фармацевтичних препаратів для запобігання окисного стресу на шкірній мембрані, наприклад, проти старіння, а також для вицвітання шкіри як антагоністів процесу меланогенезу.

Тоді як фракції, що містять антиоксидантні суміші, що видаляють, усувають вільні радикали, що містяться в структурі меланіну, виробляючи ефект вицвітання шкіри, механізм дії тирозолу діє, конкуруючи з тирозином в процесі, контрольованому ферментом, званим тирозиназою, який становить лише одну частину загальний процес меланогенезу. Насправді навіть тирозол піддається ферментативній активності тирозинази, змінюючись в гідрокситирозолі за схемою 1. Таким чином, він конкурує з тирозином у ферментативній реакції.

Тому тирозол, доставлений у глибші шари дерми, може конкурувати з тирозином за тирозинази, зменшуючи кількість дофаміну, доступного для продовження процесу меланогенезу, зменшуючи, таким чином, шкірне забарвлення.

Різні фракції та сполуки, такі як тирозол, гідрокситирозоль та ін., Отримані за допомогою описаного тут інноваційного процесу, використовувались для складання препаратів для місцевого застосування, щоб протистояти процесу меланогенезу та викликати знебарвлення та знебарвлення шкіри.

Використання поліфенолів не обмежується згаданими прикладами, але також включає приготування лаків, клеїв та композитів.

Реакція окислення тирозолу до гідрокситирозолу може проходити в гомогенній, гетерогенній або перехідній фазі, використовуючи воду та гідрокарбоновані розчинники, такі як пентан, гептан та подібні.

Каталізатор метилренію триоксид (МТО) також може бути використаний у формі, пов'язаній з інертними полімерними матрицями, такими як полі (4-вінілпіридин) та полістирол. У цьому випадку гетерогенний каталізатор, що використовується для окислення, може бути відновлений з реакційної системи простою фільтрацією і повторно використаний щонайменше десять послідовних циклів трансформації без видимих втрат активності та селективності.

У будь-якому випадку, умови гомогенного каталізу є кращими для окислення, використовуючи протонні розчинники, такі як вода, спирти C1-C3, оцтова кислота або їх суміші.

Процес окислення винаходу, очевидно, може бути здійснений на тирозолі, який не походить від способу очищення стічних вод олійниці, а також з інших джерел, наприклад комерційного тирозолу технічного класу.

Далі винахід буде більш детально проілюстровано на наступних прикладах.

ПРИКЛАД 1 Комбіноване лікування ОМВ методом мікро-, нано-, ультрафільтрації, зворотного осмосу та методами розділення та відновлення

Пілотна установка була надана фірмою Hydro Air Research відповідно до проекту заявника і складається з трьох блоків.

Другий блок складається з 2 модулів для мікрофільтрації (MF; 120 000 D; 0,24 м2 × 2).

Було проведено кілька тестів, в основному на зміну співвідношення концентрацій між просоченим та екстрактом. На етапі зворотного осмосу необхідно встановити коефіцієнт концентрації між екстрактом та проникним. Температура фізичного навантаження не повинна перевищувати 80 ° C для функціональності мембрани, але бажано менше 60 ° C для захисту цілісності метаболітів.

Можна зазначити, що згідно з описаним процесом, розробленим заявником, екстракт осмосу містить більше 1 г/л гідрокситирозолу та більше 0,6 г/л тирозолу.

Хроматограма ВЕРХ-МС фракції зворотного осмосу, повідомлена на фіг. 2, показана площа піків вище 1%.

Очищення сировини, отриманої флеш-хроматографією або хроматографією на співполімері дивінілбензол/N-вінілпіролідон, дозволило виділити:

- Тирозол з виходом вище 84% (чистота> 80%);
- Гідрокситирозоль із виходом вище 80% (чистота> 80%).

Отримані таким чином гідрокситирозоль і тирозол доводили до чистоти вище 98% за допомогою напівпрепаративної ВЕРХ-колонки в інвертованій фазі, як, наприклад, тип C18 Zorbax® від Agilent ™.

Продукти, отримані очищенням, були повністю охарактеризовані за допомогою спектроскопічних (ЯМР 1H та 13C, FT-IR) та спектрометричних методів (GC-MS, LC-MS) та доказової чистоти вище 98% (рис.3).

Фракції концентрації, отримані на різних стадіях фільтрації, як описано вище, характеризувались вимірюванням макроописових параметрів за допомогою спектроскопічних та спектрометричних методів (ФІГ. 2).

ПРИКЛАД 2 Каталітичне окислення тирозолу до гідрокситирозолу в однорідних та гетерогенних умовах

Були проведені різні реакції (схема 2), і їх результати відновлені в таблиці 3.

Найкращі результати були отримані при МТО (10% ваги порівняно з субстратом), що працює в EtOH при 20 ° C і в H2O при 45 ° C.

Результат окислення у воді особливо цікавий, оскільки реакція є високосумісною з екологією та має незначний вплив на навколишнє середовище.

Реакцію повторювали навіть за умови стадії перенесення з використанням пентану, гептану та інших подібних розчинників.

Окрім двох інших видів ренієвих гетерогенних каталізаторів, на основі гетерогенізації триоксиду метилренію (МТО) на полі (4-вінілпіридині) та полістиролі, згідно з літературою (R. Saladino та ін., "Приготування та структурна характеристика полімеру" системи триоксиду метилренію як ефективні та селективні каталізатори для епоксидування олефінів " J. Org. Хім., 2002, 67, 1323-1332).

i) Приготування полякових каталізаторів (4-вінілпіридин)/МТО

77 мг (0,3 ммоль) МТО додавали до смоляної суспензії 600 мг [полі (4-вінілпіридин) 2% або 25% зшитого з дивінілбензолом] у 4 мл етанолу і суміш перемішували протягом приблизно 1 години з використанням магнітна мішалка.

ii) Приготування мікрокапсульованого каталізатора МТО

77 мг (0,3 ммоль) МТО додавали до суспензії 600 мг полістиролу в 4 мл тетрагідрофурану (ТГФ) і суміш перемішували приблизно 1 год за допомогою магнітної мішалки. Реакційну суміш послідовно додавали н-гексаном і твердий залишок фільтрували і промивали етилацетатом. Навіть у цьому випадку доданий МТО був повністю зв’язаний з носієм, що підтверджено спектроскопічним аналізом залишку після випаровування органічної фази, використовуваної для промивання каталізатора. Аналіз за допомогою скануючого електронного мікроскопа (SEM) показує утворення ідеально сферичних мікрокапсул із середнім діаметром близько 50 мкм. Відповідний каталізатор, де МТО фізично потрапляє в мікрокапсулу, буде далі називатися PS2M.

Окисні реакції тирозолу

Всі гетерогенні каталізатори використовуються для інноваційного перетворення тирозолу в гідрокситирозоль. Деякі приклади описані нижче.

Окислювальні реакції проводились із застосуванням тирозолу для очищення стічних вод олійниці. Реакції проводили з концентрацією тирозолу 100 мг/мл в етанолі при 40 ° С з усіма гетерогенними каталізаторами, описаними раніше, з використанням невеликого надлишку перекису водню (H2O2, 2 еквіваленти) при 30% -ному розчині води у якості первинного окислювача. Спочатку для каталізаторів було обрано коефіцієнт завантаження (параметр завантаження, що відповідає ммоль активної МТО на грам смоли), рівний 0,5 (схема 3).

Це значення є особливо низьким, оскільки в промислових цілях зазвичай використовують коефіцієнт навантаження від 1,0 до 10. Реакції проводили протягом 24 год. Зрештою, їх лікували двома альтернативними методами.

Метод А: реакційну суміш розбавляють етилацетатом і додають каталітичну кількість MnO2 для знищення можливого надлишку окислювача. MnO2 відфільтровували і розчинник випаровували, отримуючи сиру реакцію, що містить переважно тирозол (непрореаговавший) та гідрокситирозоль.

Метод В: (метод аскорбінової кислоти): наприкінці реакції суміш розбавляли 3 обсягами холодного метанолу і додавали ту ж кількість у вазі (як до первинного тирозолу) аскорбінової кислоти (вітамін С). Через 15 хвилин додали 4 обсяги води, які містять високий відсоток аскорбінової кислоти, ідентичний попередньому. Перемішування слід продовжувати протягом 30 хвилин, а потім провести повторну екстракцію етилацетатом. Після однієї ночі в холодильнику об'єднані органічні фази були стабільними у вмісті Гідрокситирозолю, навіть не відокремлюючись від залишкової води сульфатом натрію. Метод В є більш ефективним, і його застосовували для продовження експериментів. Сирі продукти реакції очищали флеш-хроматографією на діоксиді кремнію, використовуючи суміш етилацетат/н-гексан або на абсорбенті силікату магнію Florisil®. В останньому випадку застосовували адсорбент Florisil® із завантаженням 5% (приклад: на 1 г суміші потрібно розділити 20 г Florisil®, приблизно 40 мл, що називається Bed Volume — BV) на так характеризується колонка:

Швидкість потоку = BV/2 мл/хв або більше

Суміш гідрокситирозоль/тирозол диспергували у 4 БВ суміші ефір/гексан 1: 1. Колонку елюювали максимум 20 BV тієї ж суміші, повністю екстрагуючи чистий тирозол із суміші колони. Колонку елюювали максимум 15 БВ ефіру, який екстрагував чистий гідрокситирозол, що містився в колонці. Результати цього наведення показані на фіг. 4 .

ПРИКЛАД 3 Застосування одного з очищених та/або напівсинтезованих (гідрокситирозольних) сполук, отриманих описаним процесом

Гідрокситирозоль, отриманий за допомогою описаного тут інноваційного процесу, застосовували на культурах ендотеліальних клітин, отриманих з ендотелію пуповинних вен людини (HUVEC), відбирали і зберігали, як описано Карлуччо та його співробітниками [Carluccio M. A., et al .; «Оливкова олія та червоне вино антиоксидантні поліфеноли пригнічують активацію ендотелію: антиатерогенні властивості фітохімікатів середземноморської дієти»; Артеросклер. Тромб. Vasc. Біол. 23, 622-9 (2003)] та на моноцитарній клітинній лінії U937, отриманій з американської колекції типових культур, вирощеної в RPMI1640, що містить 10% FCS.

Для оцінки інгібування росту клітин спостерігали проліферацію моноцитів HUVEC та U937, підраховуючи життєво важливі клітини, використовуючи метод виключення трипанового синього та використовуючи МТТ (3- [4,5-диметил (тіазол-2-іл)] - 3,3дифенілтетразолій- бромід), як описано Фабіані та його колегами [Fabiani R., et al .; «Хіміопрофілактика раку за допомогою гідрокситирозолу, виділеного з оливкової олії незайманого типу через зупинку клітинного циклу G1 та апоптоз»; Євро. Дж. Рак Поперед. Серпня; 11 (4): 351-8 (2002)].

Апоптоз оцінювали за допомогою набору Annexin V-FITC (Sigma ™) відповідно до інструкцій та аналізували FACS. Клітинні культури (10 5/мл) обробляли гідрокситирозолем, отриманим вищезазначеним промисловим процесом, протягом 48 годин перед есе апоптозу.

Гідрокситирозоль (0-100 мкмоль/л) вивчали для його впливу на ріст клітин та індукцію апоптозу в моноцитарних клітинах (U937), в HUVEC та в трансформованих ендотеліальних клітинах людини (EVC 304).

При концентрації 100 мкмоль/л протягом 48 годин гідрокситирозоль, вироблений вищезазначеним промисловим процесом, повністю пригнічує проліферацію клітин в U937, але при 30 мкмоль/л спостерігається пригнічення росту клітин приблизно на 50%. При цих концентраціях не спостерігається значних змін у розповсюдженні HUVEC та ECV304.

З цього видно, що при концентраціях in vivo гідрокситирозол, вироблений вищезазначеним промисловим процесом, інгібує проліферацію та індукує апоптоз у моноцитарних клітинах, але не в ендотеліальних.

ПРИКЛАД 4 Застосування одного з очищених (гідрокситирозольних) сполук, отриманих описаним процесом, у дермокосметичних та фармацевтичних препаратах для депігментації та освітлення шкіри

Різні фракції та сполуки Тирозол, Гідрокситирозоль та ін., Отримані описаним способом, використовувались для рецептури препаратів для місцевого застосування для протидії меланогенезу та стимулювання освітлення та депігментації дерми користувача.

Деякі приклади рецептур подаються нижче:

Перші дані, отримані з використанням цих препаратів, наведені на наступному графіку і демонструють, що після 20-денного лікування у 50% обстежених спостерігається збільшення освітлення шкіри від 2 до 3% та зменшення кольору приблизно на 2,5%. Через 60 днів у 25% обстежених спостерігалося збільшення приблизно освітлення шкіри на 6% та зменшення кольору приблизно на 8%. Фіг. 5 показані дані про препарат як "лосьйон" порівняно з плацебо.

Після застосування препарату плацебо протягом кожних 60 днів лікування не було виявлено змін параметрів, що вивчаються на шкірі. Цей результат показує, як компоненти препарату плацебо не мають позитивної дії на зменшення пігментації шкіри.

ПРИКЛАД 5 Застосування отриманих фракцій та однієї з очищених речовин (тирозол, гідрокситирозоль та ін.) Відповідно до процесу, описаного для нутрицевтичних та дієтичних препаратів

Різні фракції та тирозол, гідрокситирозоль тощо, отримані описаним способом, використовувались для рецептури нутрицевтичного та дієтичного продукту.

Тут нижче наведено кілька прикладів отриманих рецептур: