Вплив ожиріння та статі на антимікробну фармакокінетику та гостру травму нирок: перевірка доклінічної моделі

АНОТАЦІЯ

ВСТУП

Поширеність ожиріння серед дорослого населення США, за оцінками, становить приблизно 36% (1, 2). Це високе поширення ожиріння повинно викликати занепокоєння щодо нашого сучасного підходу дозування ліків, який в основному включає використання рівно фіксованих доз (незалежно від ваги) та дозування на основі ваги та площі поверхні тіла (3). Дозування на основі ваги зазвичай використовується для дозування декількох протимікробних засобів (3). З точки зору токсикології використання дозування на основі ваги може призвести до надмірного впливу та токсичності лікарських засобів через непропорційне збільшення кліренсу препарату з масою тіла у дорослих із ожирінням (4). Зокрема, такі антимікробні засоби, як аміноглікозиди, колістин, телаванцин та ванкоміцин, які вводяться у вазі, були пов’язані з гострим ураженням нирок (AKI) у людей із ожирінням (5–8).

Якщо індукований наркотиками АКІ пов’язаний із більшим впливом наркотиків у пацієнтів із ожирінням через дозування на основі ваги, тоді може знадобитися парадигма альтернативного дозування. Тестування цієї гіпотези у пацієнтів вимагає великого перспективного клінічного дослідження, яке часто є етично, фінансово та технічно складним через існуючі супутні захворювання, які заважають оцінці лікарських захворювань. Отже, тваринні моделі служать корисною альтернативою для перевірки впливу певного підходу дозування ліків на розвиток АКІ. Історично щур служив важливою моделлю для тестування AKI, викликаного наркотиками (9). Однак токсикологічний профіль більшості препаратів часто вивчається у самців щурів певного віку, що призводить до відбору групи тварин з вузьким розподілом ваги (9). Як наслідок, стандартна модель щурів може мати обмежений потенціал для клінічного перекладу для пацієнтів обох статей з більш широким розподілом ваги (9, 10). Висока поширеність ожиріння робить це обмеження в нашій доклінічній токсикологічній моделі актуальним питанням (1, 2).

За останні роки було розроблено кілька моделей ожиріння на щурах (11). Ці моделі широко включають генетично модифіковані або індуковані дієтою моделі ожиріння (11). Хоча ці моделі успішно використовувались для вивчення патологічних наслідків ожиріння, вони недостатньо використовувались для токсикологічних досліджень. Показано, що дієта, спричинена ожирінням щурів, імітує зміни функції нирок, що спостерігаються при ожирінні людини, більш точно, ніж генетично модифіковані моделі щурів (12). Крім того, зміни функції нирок найчастіше оцінюють за допомогою ендогенного біомаркеру креатиніну, який може бути нечутливим для раннього виявлення АКІ (13). В останнє десятиліття молекула 1 із пошкодженням нирок (KIM-1) та асоційований з нейтрофілом желатиназою ліпокалін (NGAL) були визначені як чутливі ендогенні біомаркери AKI (13). Зараз доступні комерційні аналізи як для KIM-1, так і для NGAL для клінічного використання.

У сукупності існує чітка можливість покращити клінічний потенціал перекладу токсикологічних даних, отриманих від щурів, (i) використовуючи тварин обох статей, (ii) оцінюючи більш широкий розподіл ваги та (iii) виявляючи AKI за допомогою чутливих біомаркерів. Отже, поточне дослідження було проведено для перевірки моделі ожиріння на щурах як системи порівняння ефектів ожиріння та статі на індукований наркотиками АКІ. В якості досліджуваного препарату було обрано гентаміцин, оскільки його дозують клінічно на основі ваги та пов’язують із АКІ, який може залежати від статі (14, 15). Кліренс гентаміцину також відомий як чудовий сурогат функції нирок, і тому зменшення його кліренсу через АКІ може служити сурогатним маркером токсичності (16, 17). Нарешті, більшість оригінальних даних, отриманих на моделях щурів, і свідчать про різницю в токсичності аміноглікозидів, пов’язану із штамом, статтю та ожирінням, були раніше використання селекційної програми Міжнародного генетичного стандарту (IGS) (14, 18–23). У цьому дослідженні порівнюються фармакокінетика, потенціал АКІ та гістопатологічні відмінності гентаміцину у щурів-самців та самок ІГС (Чарльз Рівер, Вілмінгтон, Массачусетс), які були схильні до ожиріння (OP) та стійкі до ожиріння (OR).

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Тварини. Усі процедури підготовки, моніторингу та відновлення тварин були затверджені інституційним комітетом з догляду та використання тварин перед початком дослідження. Щури OP і OR обох статей були отримані з лабораторій Charles River (Трой, штат Нью-Йорк) та підтримувались індивідуально в кліматично контрольованому віварії при 21 ° C на 12-годинному світловому/12-годинному темному циклі з їжею та водою ad libitum. Деталі щодо розвитку цього штаму були розглянуті (24). Коротко кажучи, вихідні лінії OP та OR мають повністю функціонуючий рецептор лептину і були розроблені з лінії Crl: CD (SD). Ожиріння викликається в цій моделі завдяки підтримці тварин на дієті з високим вмістом жиру. Раніше Уайт і Лі детально розробили систему для розробки та обслуговування системи розведення Crgs: CD (SD) IGS (Чарльз Рівер, Вілмінгтон, Массачусетс) (24). Щури мали вік 10 тижнів після придбання, і щури OP і OR тримали дієту на 60% жиру (RD12492; Research Diets, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі) протягом 6 тижнів. Тварин зважували щотижня під час аклімації (початкові 4 тижні) та щодня протягом експериментальної фази дозування (останні 2 тижні).

Придбання та дозування ліків. Для цього дослідження була використана одна партія (партія 90-433-DK) гентаміцину сульфату (ін’єкція, USP; Hospira, Lake Forest, IL). Було вивчено початкову групу самців щурів (5 ожиріння та 5 худорлявих), яким давали добову дозу 50 мг/кг маси тіла, але цей експеримент достроково припинили через захворюваність (див. Результати). Отже, найвища випробувана доза була зменшена на 50%. Тварин зважували щодня перед одноразовою внутрішньоочеревинною (ip) ін'єкцією трьох дозованих груп на основі ваги, яким давали гентаміцин (12,5, 18,75 або 25 мг/кг) та одній групі, яким вводили нормальний фізіологічний розчин (контроль, обсяг дози відповідав) протягом 14 днів . Було вивчено вісімдесят щурів, що дозволило розподілити по 5 щурів у кожну з 16 можливих груп, до складу яких входили 2 статі (чоловіки та жінки), 2 вагові групи (ОП та АБО) та 4 групи дозування (включаючи контроль).

Забір крові та сечі. Зразки крові відбирали з бічної хвостової вени на вихідному рівні та через 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 3,0, 6,0 та через 24 години після дози 1, дози 7 та дози 14. Кров відбирали у 2 тварин (з тієї ж групи) з розподілом часу, наприклад, щур 1 у часових точках 0,25, 0,75 та 3,0 год, від щура 2 у 0,5, 1,0 та 6,0 год, а також у обох щурів на початковому та 24-годинному періодах момент часу. Сироватку відокремлювали від цільної крові і зберігали замороженою при -70 ° C до аналізу. Сечу відбирали шляхом утримання по 2 тварини на кожну оброблювану групу індивідуально в клітинах з метаболізмом протягом 24 год після дози 1, дози 3 та дози 5. Вимірювали об’єм сечі, а аліквоти зберігали замороженими при -70 ° C до проведення аналізу.

Аналізи біомаркерів AKI. Для вимірювання концентрації біомаркерів у сечі використовували імуноферментний аналіз (ELISA) набори для 96 лунок для щурів KIM-1 (Argutus Medical, Дублін, Ірландія) та щурів NGAL (ALPCO, Salem, NH). Для вимірювання концентрації креатиніну в сечі та сироватці використовували комерційний кількісний колориметричний аналіз (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI). Всі аналізи біомаркерів проводили відповідно до вказівок виробника. Всі вимірювання були прочитані за допомогою системи зчитування пластин Tecan Infinite 200 PRO (Меннедорф, Швейцарія).

Поетапно коваріатно-байєсівські лінійні регресії заднього параметра (вперед і назад) виконувались за допомогою підпрограми PMstep в рамках PMetrics. Значні коваріати були введені в модель поетапно, і остаточний вибір моделі базувався на якості придатності та AIC. Оцінку остаточної моделі POP-PK проводили за допомогою діагностичних графіків. Діагностичні графіки включали прогнозовану популяцію та окремих індивідуумів проти спостережуваних ділянок, залишки проти часу та залишки проти передбачуваної концентрації. Візуальна прогностична перевірка остаточної моделі POP-PK була виконана шляхом першого моделювання (SIMrun) 1000 суб’єктів для кожної щури з використанням напівпараметричного підходу з подальшим накладанням (SIMparse та PMdiag) 5-го, 25-го, 50-го, 75-го та 95-го довірчих інтервалів ( CI) з часом на спостережуваних даних. Нарешті, була перевірена інтегрована фармакокінетико-фармакодинамічна модель, що порівнює площу під кривою концентрація-час, інтегровану до 24 год (AUC0-24), до біомаркерів АКІ. Додаткові подробиці щодо описаних вище процедур можна отримати за допомогою посібника PMetrics, навчальних посібників та форуму, доступних на веб-сайті LAPK (27).

Гістопатологія. Тварин приносили в жертву за допомогою регульованої процедури евтаназії вуглекислого газу (7,5%), а також проводили розтин крові на всіх щурах. Зібрані нирки зважували, двічі промивали холодним сольовим буферним сольовим розчином та зберігали у 10% забуференному формаліні. Зразки тканин були представлені для підготовки предметного стекла та мікроскопічної оцінки ветеринарним патологом, який не використовував дози (Taconic, Rockville, MD). Пошкодження нирок оцінювали за допомогою модифікованої шкали оцінки на основі відсотка загальних проксимальних канальців, що демонструють десквамацію та некроз, де 0 відповідає проксимальним канальцям у межах норми, 1 відповідає> 0% до 30% до 50%, 4 відповідає> 50 до 70%, 5 відповідає> 70 до 90%, а 6 відповідає> 90% (22).

Зміна ваги самців і самок щурів протягом 14-денного експериментального періоду на основі еталонної ваги в нульовий день (початок дозування гентаміцину).

Профіль концентрації та часу гентаміцину. Максимальна концентрація гентаміцину в сироватці спостерігалася через 0,5 год після внутрішньочеревної ін’єкції. Середні концентрації (SD) після дози 1 через 0,5 год (0,5 год) за дозуванням становили 81,9 (30,3) мг/літр, 86,3 (38,6) мг/літр та 121 (85,1) мг/літр для 12,5-, 18,75- та 25-мг/кг відповідно груп. Спостережувані концентрації з кожним режимом дозування для всієї популяції з часом проілюстровані на рис. 2А. Профіль концентрації природного логарифму в часі знижувався двофазним чином із швидким зниженням протягом перших 3 годин, а потім повільнішим зниженням між 3 та 24 годинами, як показано на рис. 2Б. Середні концентрації (SD) через 3 год (C3 год) за дозою становили 3,12 (4,40) мг/літр, 4,33 (5,46) мг/літр і 10,5 (13,2) мг/літр для 12,5-, 18,75- і 25 групи мг/кг відповідно. Середні концентрації через 24 год (С24 год) після введення дози 1 коливались від 0,290 мг/л до 1,62 мг/л.

(A) Розсіяні профілі концентрації та часу протягом 14-денного періоду для всієї популяції за дозуванням; (B) природний логарифм сироватки концентрації ентаміцину концентрація-час та пристосований (медіанний діапазон) графік за дозуванням протягом перших 24-годинного періоду.

Прогнозована популяційна (ліва) фармакокінетична модель та передбачена індивідуальна (права) модель проти спостережуваних концентрацій гентаміцину.

Оцінки фармакокінетичних параметрів популяції, коваріантність та значущі коваріати, визначені для кожного параметра для остаточної моделі з двома відділеннями, що описує дані про концентрацію та час гентаміцину

Розсіяний та сигмоїдно-придатний графік залежності між максимальним спостережуваним співвідношенням ліпокаліну, пов’язаного з нейтрофілом желатинази сечі, до креатиніну (NGAL: Cr) над площею гентаміцину під кривою концентрація-час, інтегрованою з нуля до 24 годин (AUC0–24).

Пошкоджена гематоксиліном та еозином тканина нирок (збільшення, × 4 та × 20), що демонструє ступінь 0 (контроль), ступінь 2 (ОП жінки) та ступінь 4 (АБО чоловіки) пошкодження проксимальних канальців із добовою дозою гентаміцину 25 мг/кг.

ОБГОВОРЕННЯ

Наша схема фракціонування доз на основі ваги дозволила порівняти групи, які отримували змінні абсолютні дози гентаміцину, але досягли дуже порівнянних експозицій (рис. 6). Наприклад, жіноча група ОП досягла абсолютної експозиції гентаміцину, подібної до експозиції чоловіків АБО, але ступінь АКІ за гістологією була явно вищою у чоловічої групи (рис. 5). Ця різниця між статями була також очевидна за біомаркерами АКІ та креатиніну в сироватці крові. Хоча NGAL/Cr був більш чутливим, ніж KIM-1/Cr, у чоловіків спостерігались більш високі концентрації цих біомаркерів, ніж у жінок. Крім того, NGAL/Cr можна було виявити після першої дози гентаміцину у самців щурів, але з найвищим рівнем дози у самок щурів із ожирінням виявився лише після п’ятої дози. Нарешті, гістологія остаточно продемонструвала, що в середньому у самок щурів, які отримували гентаміцин, було від 10 до 30% пошкодження проксимальних труб, на відміну від щурів-самців, які мали> 50–70% пошкодження проксимальних труб, незважаючи на порівнянний вплив.

Прогнозована модель популяційної площі під кривою концентрація-час, інтегрована до 24 год над абсолютною дозою для групи щурів.

Наші висновки у самців щурів узгоджуються з результатами Коркорана та Салазара, які вперше оцінили пошкодження органів, спричинених наркотиками, у ожирілих перегодованих щурів (18, 19). Раніше вони демонстрували АКІ у самців щурів протягом 5 днів після лікування гентаміцином у дозі 30 мг/кг, що вводили внутрішньовенно. кожні 12 год (19). Модель була створена шляхом віднесення щурів-самців до енергетично щільної дієти (група з ожирінням) або до стандартної дієти (худа група) протягом 52 тижнів (19). Ця дієта призвела до середньої різниці у вазі між ожирілими та худими самцями щурів у 1,8 рази. Навпаки, наша модель використовувала стандартизовану енергетично щільну дієту в обох групах, тестувала обидві статі та встановила середню різницю у вазі між групами у 2,2 рази. Ця різниця у вазі була встановлена за набагато коротший час (14 тижнів проти 52 тижнів) і усунула вплив дієти як зовнішнього споживача при порівнянні груп лікування. Ми також використовували молодших щурів, що важливо, враховуючи, що вік також може впливати на токсикологічний потенціал ксенобіотиків (29). Отже, ця модель може визначити взаємодію віку, статі та ожиріння з токсикологією в майбутньому. Нарешті, ця модель використовувала щурів IGS, що дозволяє повторювати та підтверджувати наші результати іншими дослідницькими групами.

Як і будь-яке дослідження, наша робота має важливі обмеження, які слід враховувати. По-перше, ми не оцінювали вплив частоти дозування на виникнення ГІК, викликаного гентаміцином. Тобто, ми не завершили дослідження фракціонування дози (за частотою), щоб краще визначити потенційну залежність між альтернативними фармакокінетичними параметрами гентаміцину, такими як максимальна концентрація лікарського засобу в сироватці крові (Cmax) та Cmin від виникнення AKI. По-друге, ми оцінили лише один часовий момент для гістології (після дози 14) та 3 ранні часові моменти (після доз 1, 3 та 5) для біомаркерів AKI. Наше невдале розподілення чітко визначеного зв’язку експозиції та токсичності з даними гістології та біомаркерів, ймовірно, було наслідком цього обмеженого періоду оцінки та діапазону впливу. Ми продемонстрували взаємозв'язок між максимальним співвідношенням NGAL: Cr та AUC0–24, але обмежена кількість вимірювань у верхньому діапазоні експозиції вимагає обережності при інтерпретації цього висновку. Нарешті, і найголовніше, ми не оцінили механістичний шлях для цієї різниці за статтю в ГІК, викликаній гентаміцином. Попередні дослідження також показали цей статевий диморфізм при індукованому наркотиками АКІ, але також не змогли визначити чітке механістичне пояснення цієї знахідки (10).

Незалежно від того, поширюється ця статева знахідка на інші ксенобіотики, розумно принаймні оцінити потенціал різниці в токсичності між статями за вагою за допомогою доклінічних експериментів (10). Особливо це стосується нових молекулярних утворень, таких як неоглікозиди, які розробляються у відповідь на підвищення грамнегативної стійкості організму (30). Оцінку цього потенціалу та різниці статевих ознак для АКІ слід також проводити для інших поширених антимікробних препаратів, таких як ванкоміцин, телаванцин, колістин та поліміксин В. Наша розробка нової токсикологічної моделі створює можливість переоцінити токсикологічний потенціал ліків, які дозуються на вазі та виводяться нирками. Хоча наша оцінка була обмежена нирками, вплив ожиріння та статі на дозування наркотиків та токсикологію, ймовірно, пошириться на інші органи-мішені. Дослідження цієї моделі для оцінки поліорганного токсикологічного потенціалу ксенобіотиків у різних розмірах тіла є необхідним. Комерційна доступність цієї моделі ожирілих, перегодованих щурів, забезпечує швидку, просту та потенційно вигідну платформу для з’ясування впливу розміру тіла на антимікробну фармакокінетику та токсикологію.

ПОДЯКИ

Це дослідження фінансувалось частково за рахунок гранту Фонду нирково-східних нирок.

Ми визнаємо підтримку Томаса П. Лодіза-молодшого (редакційна редакція) та Роджера В. Джелліффа та Майкла Н. Нілі у навчанні з використання та застосування програми PMetrics.