Вивчіть вплив пробіотичних бактерій, виділених з харчових продуктів, на патогени

Стаття дослідження - Біомедичні дослідження (2018) Том 29, Випуск 12

Вивчіть вплив пробіотичних бактерій, виділених з харчових продуктів, на патогени

Abeer Abu Zaid 1,2 *

1 Департамент спеціальної їжі та харчування, Науково-дослідний інститут харчових технологій, Центр досліджень сільського господарства, Гіза, Єгипет

2 Відділ біології, природничий факультет, Університет Таїф, Саудівська Аравія

* Автор-кореспондент: Абір Абу Заїд
Кафедра біології
Факультет природничих наук
Університет Таїф, Саудівська Аравія

Дата прийняття: 26 лютого 2018 р

Відвідайте для отримання додаткових статей за адресою Біомедичні дослідження

Анотація

Одинадцять штамів Bacillus було виділено з продуктів харчування та оцінено їх пробіотичний потенціал та безпеку. Потім вивчіть вплив виділених штамів на патогени та на популяцію патогенів у відновленому знежиреному молоці (RSM). Сім штамів від Bacillus sp. (3) та Bacillus subtilis (4) були відібрані, які вирощували при низькому рН 1,0 до 5,0 та толерантній жовчній солі від 0,3 до 2%, високо стійкій до змодельованих станів шлунково-кишкового тракту, та демонстрували антимікробну активність проти Salmonella typhimurium ATCC20231 та Staphylococcus aureus ATCC25923. Вони мали чутливість до антибіотиків проти 6 перевірених антибіотиків. Крім того, він виявляється негемолітичним на овечій крові. Два патогени були повністю пригнічені через 60 та 72 години інкубації з вибраними пробіотичними штамами в RSM. Результати показують, що Bacillus subtilis або Bacillus sp. може використовуватися як пробіотичні культури для кормів тварин та людей, ферментованих овочів, молока, м'ясних продуктів, а також для досягнення біоконсервації молочних продуктів у харчовій промисловості.

Ключові слова

Штами пробіотиків, Bacillus sp., Антибактеріальні, Антибіотичні, ШКТ

Вступ

Хвороба, що передається через їжу, є головною міжнародною проблемою охорони здоров'я у всьому світі, і вона знизила економічне зростання, хоча посилила ефективність ефективного законодавчого контролю за процедурами переробки харчових продуктів у галузях [1]. Діарейні захворювання, що передаються через їжу, є причинами захворювань та смерті

2,2 млн. Людей щорічно і понад 200 видів хвороб, що передаються харчовими продуктами [2,3]. Цими збудниками є Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi., Bacillus cereus, дріжджі та цвілі. Використання природних антимікробних засобів без будь-яких негативних наслідків для здоров’я людини для стримування поширення патогенних мікроорганізмів у харчових продуктах, тобто може бути проблемою, пов’язаною із забрудненням їжі.

Вираз «пробіотики» був плагіатом із грецького слова, що означає «на все життя» [4]. Після цього пробіотики визначали як «живі мікроорганізми», які при введенні в достатній кількості надають корисного здоров’я господареві, покращуючи мікробний баланс у кишечнику [5,6]. Пробіотичні бактерії можуть виробляти різні антимікробні метаболіти, до яких належать органічні кислоти (молочна та оцтова кислоти) та бактеріоцини. Органічні кислоти не тільки знижують рН, але вони також можуть бути токсичними для збудників. Корисними пробіотичними бактеріями є профілактика та лікування захворювань при шлунково-кишкових розладах, таких як дизентерія, діарея, черевний тиф [7].

Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus, Leuconostoc, Bacillus та багато інших інтегровані у перелік пробіотиків [8]. Загальновизнано, що пробіотики мають певні властивості, такі як; толерантність до шлункового соку та жовчі, адгезія до епітеліальних клітин кишечника, виживання в шлунково-кишковому тракті людини та тварин та поліпшення мікробного балансу кишечника [9].

Пробіотики, як і звичайні мікроорганізми, можуть мати такі небажані властивості, як поява шкідливих біохімічних факторів та факторів вірулентності. Вони не є споровими і можуть руйнуватися при високій концентрації жовчі в дванадцятипалій кишці та шлункових кислотах. Тому велика кількість бактерій-пробіотиків вимагала виживання в анаеробних кишках. Для вирішення цієї проблеми триває безліч досліджень щодо застосовності нових спороутворюючих пробіотиків Bacilli, таких як; Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus polymyxa та Bacillus mesentricus. Вони непатогенні і в природі містяться у воді та ґрунті, ферментують велику кількість цукрів, виділяють ферменти протеази, ліпази та амілази, виживають у шлунку та потрапляють у кишечник для проростання та термостійкі.

Види паличок є грампозитивними паличками, виробляють жароміцні суперечки і широко поширені в навколишньому середовищі або багатьох видах їжі. B. subtilis не шкідливий для ссавців, включаючи людей, і є комерційно важливим як виробник високодисперсних хімічних речовин та ферментів та різноманітної кількості вторинних метаболітів, таких як антибіотики, а також гетерологічних білків, антигенів та вакцин [7,10,11] . B. subtilis ефективно росте з недорогими джерелами вуглецю та азоту, оскільки його ферменти дуже ефективно розщеплюють велику кількість білків, вуглеводів та ліпідів тваринного та рослинного походження на складові одиниці [12]. Спори B. subtilis мають здатність протистояти екстремальним умовам рН, УФ-опроміненню, високим температурам, розчинникам і тривалим періодам зберігання без охолодження [13]. В огляді, B. subtilis має пристосованість до використання поживних речовин для росту, виробляє високий рівень ферментів, секрецію антимікробних сполук, розвивається в аеробних та анаеробних умовах, а B. subtilisis загальновизнано безпечним (GRAS) Управлінням з контролю за продуктами та ліками (FDA) ). Нарешті, B. subtilis у "теорії" можна добре виміряти як ідеальну багатофункціональну пробіотичну бактерію для господарів [11,14-17].

Метою цього дослідження є оцінка потенційних властивостей пробіотиків бактерій Bacillus, виділених з їжі, та їх антибактеріальної дії проти патогенезу. Нарешті, вивчіть ефект спільного культивування пробіотичних бактерій з патогенними в знежиреному молоці.

Матеріал та методи

Штами бактерій

Одинадцять штамів бактерій (M01-M11) були виділені в аеробних умовах з дванадцяти традиційних харчових продуктів; далі всі штами були ідентифіковані частковим секвенуванням генів 16SrRNA та філогенетичним аналізом. Всі штами були ідентифіковані за 97-100% ідентичністю, включаючи Bacillus circulance (4), Bacillus sp. (3) та Bacillus subtilis (4), згідно Зайду [18]. Стандартні біохімічні тести, такі як грамова реакція, спороутворювач, рухливість, реакція каталази, оксидазна активність, гідроліз ескуліну проводились після стандартної оцінки [19].

Пробіотичний потенціал

Допуск рН: Ізоляти інокулювали в стерильні пробірки з поживним бульйоном (NB) з різним рН, тобто 1,2, 3, 4 та 5, інкубували при 37 ° C протягом 24 годин. Потім 0,1 мл інокулятів з кожної пробірки виливали у вигляді поживного агарового середовища методом заливки та інкубували при 37 ° С протягом 48 годин. Ріст бактерій на агарі використовували для позначення ізолятів як стійких до рН [7].

Толерантність до жовчної солі

Середовище з різними концентраціями жовчної солі (0,3, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 та 4,0%) інокулювали з кожною обраною бактеріальною культурою та інкубували при 37 ° С протягом 48 годин. Потім 0,1 мл інокулятів переносили в поживний агар методом заливки та інкубували при 37 ° С протягом 48 годин. Ріст бактерій на агаровій пластині використовували для позначення ізолятів як толерантних до жовчних солей [7].

Гемолітична активність

Для перевірки гемолітичної активності ізоляти наносили на агарові пластини Колумбії; містить 5% (мас./об.) овечої крові [20].

Сприйнятливість до антибіотиків

Вибрані штами Bacillus оцінювали на чутливість до антибіотиків, використовуючи метод дифузії агару на агарі Мюллера Хінтона [21]. Антибіотики, такі як ампіцилін (Am 10 U); пеніцилін (Р 10 мг); налідиксової кислоти (NA, 30 мкг); ванкоміцин (V, 30 мкг); колістин (CS, 10 мкг); тетрациклін (Т, 10 мкг); Гентаміцин (ГМ, 10 мг); Фузидова кислота (FA, 10 U). Усі антибіотики були придбані у Bio-Rad, Laboratories, GmbH., Німеччина. Виділяє культуральну суспензію, що містить

10 6 КОЕ/мл 18-годинної культури при 37 ° С, а потім стерильним ватним тампоном наносили на агар. Вивчені антибіотичні диски асептично розміщували на пластинах. Діаметри зони гальмування розраховували в мм під лічильником колонії через 24 години інкубації.

Вплив змодельованих шлунково-кишкових станів

За словами Zago та співавт., Були розроблені імітаційні шлунково-кишкові захворювання [1]. Зростання ізолятів при рН 2,0 у присутності 1% лізоциму, 1% трипсину та 0,3% жовчної планки в триптичному соєвому відварі (TSB) використовували для позначення ізолятів як імітованих шлунково-кишкових станів.

Антимікробна активність

Для виявлення активності антагонізму використовували агаровий плямовий тест [22]. Культури протягом ночі на середовищі NB штамів, що підлягали випробуванню на вироблення антимікробної сполуки, центрифугували (10 хв при 15000 г, 4 ° С). Безклітинні супернатанти фільтрували через ацетатний целюлозний фільтр (0,2 мкм) для видалення залишкових клітин. Культуру цільового штаму протягом ночі (37 ° С) розбавляли в стерильному середовищі Мюллера-Хінтона, і 1 мл 10 6 КУО розподіляли на твердому середовищі Мюллера-Хінтона. Чашки Петрі сушили протягом 10 хв. Пробковий свердло використовувався для пробивання одного отвору діаметром 4,1 мм. Поживний агар використовували для герметизації дна отворів. Зразки (30 мкл) відфільтрованих безклітинних супернатантів переносили на агарову платівку. Цільовими штамами, що використовуються в цьому дослідженні, є Salmonella typhimurium ATCC20231 та золотистий стафілокок ATCC25923.

Вплив спільного культивування пробіотичних бактерій з патогенними

Цей метод був використаний для вивчення впливу пробіотичних бактерій на популяцію патогенних речовин у відновленому знежиреному молоці (RSM). 9 мл RSM інокулювали 1 мл культури пробіотичних бактерій протягом ночі та 0,1 мл патогенних. Інокульоване середовище RSM добре перемішували та інкубували при 37 ° C протягом 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 год. Після інкубації популяцію псування та патогенних бактерій підраховували на поживному агарі [23].

Статистичний аналіз

Фігура 1: Вплив спільного культивування з пробіотичними бактеріями у відновлених знежирених молочних середовищах на логарифмічну популяцію Salmonella typhimurium.

Малюнок 2: Вплив спільного культивування з пробіотичними бактеріями у відновлених знежирених молочних середовищах на журнал популяції золотистого стафілокока.

Золотистий стафілокок був більш стійким у присутності Bacillus subtilis та Bacillus sp., Він повністю пригнічувався через 72 год інкубаційного періоду. Штами Bacillus circulan мають подібну поведінку контролю, як показано з результатів, і псують всі зразки через 48 годин інкубаційних періодів. Той самий висновок Денкової та співавт. дійшов висновку, що кишкова паличка та сальмонела чутливі до присутності пробіотичних бактерій і під час спільного культивування здійснюють повне гальмування до 60-ї до 72-ї год інкубації [23]. З іншого боку, золотистий стафілокок виявив стійкість до присутності пробіотичних бактерій у середовищі, але цей збудник був чутливим до Bif. Тільки штам біфідум.

На закінчення сім штамів (4 Bacillus subtilis та 3 Bacillus sp.) Не виявляли гемолітичної активності (γ-гемоліз), антибактеріальної активності, переносили низький рН 2,0, жовчна сіль до 0,3%; життєздатний при стресі зі стимуляцією шлунково-кишкового тракту (СГІТ). Ці штами настійно рекомендується використовувати як пробіотики, і їх можна виміряти як загальновизнані як безпечні (GRAS) бактерії. Інші чотири штами Bacillus circulan мають здатність до неповного гемолізу (α-гемоліз) і втратили один із важливих критеріїв (толерантність до кислоти та жовчі), тому необхідна подальша робота з оцінки їх безпеки для використання в якості пробіотиків. Можна зробити висновок щодо комбінації різних штамів пробіотиків, щоб завершити пригнічення росту бактерій та спор. В результаті проведених досліджень штами Bacillus subtilis та Bacillus sp. мали високу антимікробну активність, важливо для застосування цих пробіотичних штамів у продуктах харчування, щоб продовжити термін придатності. Штами пробіотиків Bacillus використовувались для виробництва функціональних продуктів харчування (йогурт; біойогурт; хліб з подовженим терміном зберігання; м'ясо-сирі продукти; сири; органічне консервування косметичних кремів).