Терапевтична дія ферментованого молока Streptococcus thermophilus CRL 1190 на хронічний гастрит

ЦІЛЬ: Дослідити потенційний терапевтичний ефект продукування екзополісахаридів (EPS) Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) CRL 1190 ряжанка на хронічний гастрит у мишей Balb/c.

МЕТОДИ: Мишей Balb/c годували ферментованим молоком протягом 7 днів після індукції гастриту ацетил-саліциловою кислотою (АСК, 400 мг/кг маси тіла на день протягом 10 днів). Омепразол був включений у це дослідження як позитивний терапевтичний контроль. Запальну активність шлунка оцінювали за гістологією шлунка та оцінкою запалення, кількістю інтерлейкіну-10 (IL-10), інтерферону-γ (INFγ) та фактором некрозу пухлини-α (TNF-α), що продукують цитокіни в слизовій оболонці шлунка, і товщину шару слизу.

РЕЗУЛЬТАТИ: Тварини, які отримують лікування EPS-продукуючим S. thermophilus Зброджене молоко CRL 1190 продемонструвало збережену структуру слизової шлунка, подібну до структури здорових тварин. Оцінка запалення у ферментованих молоком мишей була нижчою, ніж у мишей групи гастриту (0,2 ± 0,03 проти 2,0 ± 0,6, P + (15 ± 1,0 проти 28 ± 1,2, P + (16 ± 3,0 проти 33 ± 3,0, P + (28 ± 1,5 проти 14 ± 1,3, P Молочнокислі бактерії, пробіотики, гастрит, Streptococcus thermophilus, екзополісахариди

Цитування: Родрігес С, Медічі М, Моцці Ф, Вальдес Г.Ф. Терапевтична дія ферментованого молока Streptococcus thermophilus CRL 1190 на хронічний гастрит. Світ J Gastroenterol 2010 р .; 16 (13): 1622-1630
URL:https://www.wjgnet.com/1007-9327/full/v16/i13/1622.htm
DOI:https://dx.doi.org/10.3748/wjg.v16.i13.1622

Гастрит - це поширене захворювання, при якому спостерігається розрив слизової оболонки шлунка. Це викликано кількома факторами, такими як алкоголь, стрес, зараження хелікобактер пілорі (H. pylori) [1 - 3], що призводить до дисбалансу між наступальною секрецією кислоти-пепсину та захисними факторами слизової оболонки, такими як секреція муцину та випадання клітин [4]. Нестероїдні протизапальні засоби (НПЗЗ), такі як ацетил-саліцилова кислота (АСК), використовуються у всьому світі як протизапальні та знеболюючі засоби при лікуванні хронічних захворювань, таких як ревматоїдний артрит та остеоартрит [5], а також для профілактики. серцево-судинних захворювань. Однак пошкодження шлунково-кишкового тракту є серйозним несприятливим ефектом НПЗЗ, що викликають широкий спектр токсичних ефектів, головним чином у шлунку [6], токсичність АСК пояснюється прямим пошкодженням клітин слизової [7]. Крім того, АСК впливає на різні захисні лінії слизової оболонки, такі як секреція бікарбонату, синтез слизу, зменшення кровотоку слизової [8, 9], посилюючи запальний процес шляхом експресії прозапальних цитокінів [10]. .

Серед найбільш звичних препаратів, що застосовуються для лікування гастриту, є інгібітори протонної помпи, такі як омепразол (ОМ) [11]; однак більшість із цих препаратів також спричиняють небажані побічні ефекти та взаємодії з лікарськими засобами [12]. .

Пробіотики - це «живі мікроорганізми, які при споживанні в достатній кількості приносять користь для здоров’я господареві [13]». Пробіотичні продукти, що містять молочнокислі бактерії (LAB), використовувались для лікування різних шлунково-кишкових розладів, таких як виразка шлунка та запалення, пов’язані з H. pylori інфекція, шлунково-кишкові інфекції або діарея, пов’язана з антибіотиками [14 - 16], забезпечуючи благотворний вплив на господаря шляхом модуляції імунних функцій, наприклад системна продукція цитокінів [17]. Імунна система слизової оболонки функціонально розділена на ділянки, де поглинаються чужорідні антигени і зустрічаються з імунними клітинами, щоб ініціювати імунну відповідь через мережу сигналів між різними популяціями клітин. Ця клітинна мережа високо інтегрована продукуванням цитокінів і точно регулюється селективною експресією рецепторів цитокінів. Підмножини клітин Т-хелперів (Th) та структури цитокінів визначають природу імунної відповіді [18] .

Деякі штами LAB секретують екзоцелюлярні вуглеводні полімери, названі екзополісахаридами (EPS). Існує велика різноманітність EPS від штамів LAB щодо їх хімічних характеристик, виходу, технологічних та функціональних властивостей [19 - 21]. СЕП відіграють важливу роль у молочній промисловості, головним чином у виробництві йогуртів та деяких видів сирів, таких як чеддер зі зниженим вмістом жиру та моцарела [22], покращуючи структурні, плавильні та сенсорні характеристики продуктів. Оздоровчий ефект, що приписується пробіотичним штамам або продуктам харчування, виникає не тільки від самих бактерій, але й від метаболітів, що утворюються під час бродіння.

Стверджується, що EPS від LAB бере участь у різних регуляторних процесах, таких як імуномодулююча, знижуюча холестерин та противиразкова діяльність [23, 24]. У попередній роботі [25] ми продемонстрували, що миші Balb/c годували ферментованим молоком з продукуванням EPS S. thermophilus CRL 1190 був ефективним у профілактиці гастриту завдяки модуляції імунної відповіді та підтримці шару слизу. У цьому дослідженні розглянуто можливе терапевтичне застосування ферментованого молока, приготовленого з використанням EPS-продукуючого S. thermophilus Штам CRL 1190 для лікування АСА-асоційованого хронічного гастриту.

S. thermophilus У цьому дослідженні було використано CRL 1190. Раніше цей штам був відібраний за фізико-хімічними властивостями його полісахариду [20], не виявляючи вторинних ефектів, таких як бактеріальна транслокація (печінка та селезінка), та за ефективність у запобіганні гастриту, індукованому АСК [25]. Штам культивували (10 мл/л посівного матеріалу) у відварі LAPTg (пептон, 15 г/л; триптон, 10 г/л; дріжджовий екстракт, 10 г/л; глюкоза, 10 г/л; і твін 80, 1 мл/Л) і переробляють щонайменше двічі у відновленому знежиреному молоці (RSM, 100 г/л) безпосередньо перед експериментальним використанням. Штам підтримували при -20 ° C в RSM, що містив 100 мл/л гліцерину, 10 г/л глюкози та 5 г/л дріжджового екстракту.

Зброджене молоко готували в стерильному RSM (стерилізували при 115 ° C протягом 20 хв і охолоджували до 37 ° C) з використанням інокуляту 10 мл/л активної культури штаму EPS + S. thermophilus CRL 1190 (з назвою FM 1190), інкубували при 37 ° C протягом 16 годин і підтримували при 4 ° C перед експериментальним використанням. В якості контролю використовували неферментоване молоко.

Шість тижневих мишей-самців Balb/c (25-30 г) отримували із закритої колонії, що утримувалася у тваринницьких приміщеннях CERELA та утримували в кімнаті з 12-годинним циклом світло/темрява при 20 ± 2 ° C. Тварин окремо розміщували в клітках (20 см × 30 см × 15 см) з підстилкою для підстилки (20 см × 30 см × 6 см) і мали вільний доступ до звичайного збалансованого раціону та води ad libitum. Усі миші не отримували їжі протягом 24 годин до аналізів, але мали вільний доступ до води. Протоколи для тварин були затверджені Етичним комітетом з догляду за тваринами CERELA.

Хронічний гастрит був індукований відповідно до протоколу, стандартизованого в нашій лабораторії [25]. Пероральне введення ASA (BAYER ®), що надходить у питну воду, що дається у приблизній добовій дозі 400 мг/кг на день протягом 10 днів індукованого хронічного гастриту у мишей Balb/c (група гастриту, G). Введена доза була вдвічі більшою за аналгетичну дозу для мишей і застосовувалась для індукції гастриту протягом короткого експериментального періоду. Здорові миші (H) отримували питну воду без АСК протягом того ж експериментального періоду (група негативного контролю).

Щоб оцінити терапевтичний ефект FM 1190 на модель хронічного гастриту, тварин випадковим чином розділили на 6 груп (n = По 5): (1) група Н: отримувала питну воду без АСК протягом 10 днів; (2) група G: отримувала ASA протягом 10 днів, як описано вище; (3) Група FM 1190: отримав FM із продукуючим EPS штам CRL 1190 протягом 7 днів після індукції гастриту. Вводили FM 1190 ad libitum у приблизній дозі 10 8 КОЕ/мл; контролювали щоденне споживання кисломолочного молока і споживали його на рівні 5 мл/день; (4) Група омепразолу (ОМ): отримувала ОМ (використовувалась як позитивний контроль при ураженнях шлунка, спричинених АСК), у добовій дозі 30 мг/кг на день [26] протягом 7 днів після індукції гастриту; (5) Молочна група (М): отримували неферментоване молоко протягом 7 днів після індукції гастриту; та (6) Група води (W): отримана вода протягом 7 днів після індукції гастриту (використовується як негативний контроль).

Визначити, чи виробляється EPS S. thermophilus CRL 1190 (EPS 1190) мав антигастритну дію, полімер виділяли з 16-годинних молочних культур, вирощених при 37 ° C, методом депротеїнізації/осадження з 200 г/л (кінцева концентрація) трихлороцтової кислоти та етанолу ( співвідношення 1: 3) [20], додатково очищали, як описано раніше [19], і сушили ліофілом та зберігали при 4 ° C до використання. EPS 1190 ресуспендували в RSM (M-EPS 1190) або у воді (W-EPS 1190) і вводили мишам внутрішньошлунково в дозі 4 мг/кг на день протягом 7 днів після індукції гастриту. Кількість введеного EPS розраховували на основі кількості EPS, отриманої тваринами, коли їх годували FM 1190.

Після експериментального періоду (день 11 для груп 1 і 2 та день 18 для груп, що залишилися) мишей забивали шляхом вивиху шийки матки та зважували. Шлунки асептично видаляли, зважували і кілька разів промивали сольовим розчином і використовували для аналізів, описаних нижче.

Шлунки фіксували у 10% параформальдегіді в 0,1 моль/л фосфатно-забуференному сольовому розчині (PBS) рН 7,0 і вкладали у парафін, дотримуючись методики Сент-Марі [27]. Три серійні парафінові зрізи (4 мкм) кожного зразка вирізали з кожного зразка та фарбували гематоксилін-еозином з подальшим дослідженням світлової мікроскопії (Leica DM LS2, Wetzlar, Німеччина). Патологічні характеристики та ступінь запалення слизової оболонки шлунка оцінювали за оновленою Сіднейською системою [28] шляхом мікроскопічного спостереження без відома експериментальних груп і виражали наступним чином: нормальний вигляд розсіяних мононуклеарних клітин у власній пластині (такий же ступінь, як здорові контрольні миші): немає = оцінка 0; слабка інфільтрація одноядерних клітин у власну пластинку та підслизову оболонку та відсутність ерозії в епітелії: слабка = оцінка 1; помірна інфільтрація одноядерних клітин у власній пластині та підслизовій оболонці та відсутність ерозії в епітелії: помірний = бал 2; серйозна інфільтрація одноядерних клітин у власну пластинку та підслизову оболонку та ерозія в деяких частинах епітелію: важка = оцінка 3.

Гістологічні зрізи антральної та корпусної частин шлунка, оброблені, як описано раніше, депарафінізовані та регідратовані у градуйованій серії етанолу. Після інкубації при кімнатній температурі протягом 30 хв у блокувальному розчині бичачого сироваткового альбуміну (Sigma Chemical Co.) 10 г/л, гістологічні зрізи інкубували при 37 ° С протягом 60 хв з кролячим анти-мишачим IL-10 або INF-γ ( Peprotech Inc., NJ, США) або TNF-α (eBioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) поліклональні антитіла. Потім зрізи двічі промивали сольовим розчином і обробляли 1/10 розведенням козячого анти-кролячого антитіла, кон’югованого з флуоресцеїновим ізотіоціанатом (FITC) (Jackson Immuno Research Inc., PA, USA) при 37 ° C протягом 45 хв; знову промивають сольовим розчином і досліджують за допомогою флуоресцентного світлового мікроскопа (Leica DM LS2). Результати виражали як кількість клітин, що продукують IL-10, INF-γ та TNF-α (флуоресцентні клітини) на 10 полів (збільшення × 1000) [29]. Дані були отримані підрахунком 30 полів з 3 гістологічних зрізів для кожної групи тварин.

Шар слизу визначали періодичним фарбуванням кислотою-Шиффом (PAS) [30]. Коротко кажучи, після депарафінізації та регідратації зрізи тканин окислювали 10 мл/л періодичної кислоти протягом 5 хв. Потім їх промивали в дистильованій воді і фарбували реактивом Шиффа протягом 10 хв. Після другого промивання дистильованою водою зрізи тканин фарбували гематоксиліном і промивали проточною водою з-під крана. Нарешті, вони були зневоднені, очищені та змонтовані. Зрізи переглядали під мікроскопом (Leica M LS2), а товщину слизовиділяючого шару в слизовій оболонці тіла та антрального відділу оцінювали за допомогою аналізатора зображень (× 1000) і відношення товщини шару гелю слизу до товщини пластинки власної слизової розраховували у відсотках.

Експериментальні дані виражали як середнє значення ± SD і статистично оцінювали дисперсійним аналізом (ANOVA) за допомогою програмного забезпечення SPSS. Дані декількох груп аналізували за допомогою одностороннього ANOVA та тесту множинного порівняння Тукі. Відмінності вважалися статистично значущими при P A: H (здорова) група; В: група G (гастрит); C: група FM 1190 (ряжанка з Streptococcus thermophilus CRL 1190); D: група ОМ (омепразолу); Е: М (молочна) група; F: група W (вода); G: Група M-EPS 1190 (EPS, вироблений S. thermophilus CRL 1190, ресуспендований у молоці), показав збережені гістологічні структури; та H: Група W-EPS 1190 (EPS, вироблений Стреп. термофільний CRL 1190, ресуспендований у воді) показав хронічні запальні інфільтрації на поверхні слизової оболонки (гематоксилін та еозин, світловий мікроскоп, × 100).

Шлунки мишей групи G продемонстрували значне зниження регуляторних клітин, що продукують цитокіни (IL-10 +: 14 ± 1,3 проти 22 ± 1,7, P +: 28 ± 1,2 проти 14 ± 1,0 та TNF-α +: 33 ± 3,0 проти 15 ± 2,0, P Результати представлені як засоби 3 визначення і виражаються як кількість клітин, що продукують IL-10-, INF-γ- та TNF-α на 10 полів (збільшення × 100). a P

Терапевтичне введення FM 1190 мишам регулювало запальний процес шлунка, значно зменшуючи кількість прозапальних клітин, що продукують цитокіни (INFγ +: 15 ± 1,0 проти 28 ± 1,2, P + 16 ± 3,0 проти 33 ± 3,0, P +: 28 ± 1,5 проти 14 ± 1,3, P + значення трохи вищі за ці 2 групи (28 ± 1,5 проти 20 ± 2,9; 28 ± 1,5 проти 22 ± 1,7 відповідно, P + клітин та збільшення кількості обох запальних клітин, що продукують цитокіни (INFγ + - та TNF-α +), подібних до клітин групи G (рис.3), було виявлено в групах M та W, які використовувались як контролі.

M-EPS 1190, але не W-EPS 1190, зміг модулювати індукований гастрит подібно до FM 1190, демонструючи зменшення кількості прозапальних клітин, що продукують цитокіни (INFγ +: 15 ± 2,0 проти 28 ± 1,2, P +: 20 ± 2,6 проти 33 ± 3,0, P +: 21 ± 2,1 проти 14 ± 1,3, P В: Співвідношення товщини шару гелю слизу до слизової оболонки власного шару в слизовій оболонці тіла та антрального відділу. Б: Репрезентативні мікрофотографії слизової тіла різних груп. Зрізи фарбували за допомогою реагенту PAS. Значення представляють середнє значення ± SE середнього значення для 5 мишей. a P b P

Активність мієлопероксидази як маркера інфільтрації нейтрофілів у шлунковій тканині аналізували, але її не можна було використовувати як запальний параметр у моделі хронічного гастриту, оскільки отримані значення були подібними до значень здорових груп (дані не наведені).

Тільки молоко, вода, омепразол або готове ряжанка не завдали шкоди як такі на слизовій шлунку здорових тварин.

Щоб визначити, чи терапевтичний ефект, отриманий після введення FM 1190, був результатом присутності його EPS, отриманий біополімер виділяли, очищали та ресуспендували в молоці чи воді та аналізували його потенційний терапевтичний ефект. Як зазначалося раніше [25], лише розчинений у молоці EPS (M-EPS 1190) демонстрував подібну поведінку до ферментованого молока щодо цитокінового профілю та гістологічних структур, що свідчить про те, що взаємодія білків EPS-молоко відіграє важливу роль у модуляція імунної відповіді і, отже, терапевтичний ефект, що спостерігається. Повідомляється, що білки сироватки мають на додачу до харчової цінності біологічні функції, включаючи імуномодулюючу активність [46]. Розанелі та ін [47] повідомив про захисну дію концентрату сироваткового білкового сироватки бичачого молока на виразкові ураження, спричинені введенням індометацину. Більш того, гастрозахисний ефект α-лактоальбуміну, одного з основних білків сироватки, проти пошкодження шлунка, спричиненого етанолом, був продемонстрований шляхом посилення механізмів захисту шлунка, таких як синтез і секреція муцину в клітинах, що продукують слиз [48-50]. .

Дані висновки вказують на те, що молоко зброджували S. thermophilus CRL 1190 та/або його EPS є ефективним у терапевтичному лікуванні хронічного гастриту шляхом модуляції імунної відповіді мишей та збільшення товщини шару шлункового слизу. Таким чином, застосування цього ферментованого молока та/або його EPS представляє потенційну природну альтернативу для профілактики та лікування пошкодження шлунку, пов’язаного з АСК.

Гастрит - це поширене захворювання, при якому спостерігається розрив у слизовій оболонці шлунка. Це обумовлено кількома факторами, включаючи інтенсивне споживання протизапальних препаратів, таких як ацетил-саліцилова кислота (АСК), які зазвичай використовуються для лікування хронічних захворювань та профілактики серцево-судинних патологій. Звичайні препарати, що застосовуються як терапія проти гастриту, часто дають небажані побічні ефекти. Введення специфічних пробіотиків забезпечує нову терапію проти шлункових захворювань.

За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я, гастрит вражає 80% населення у всьому світі. Запропоновано використання пробіотиків для полегшення різних розладів шлунково-кишкового тракту, таких як запальні захворювання кишечника, діарея, синдром подразненого кишечника, тощо.; однак, захворювання шлунка приділяється мало уваги. Таким чином, автори вирішили дослідити терапевтичний ефект молока, збродженого екзополісахаридом (EPS), що продукує S. thermophilus CRL 1190 та його полімер щодо хронічного гастриту, індукованого аспірином у мишей.

Це дослідження вперше демонструє терапевтичний ефект ряжанки з полімер-продукуючим штамом S. thermophilus CRL 1190 та/або його EPS на хронічний гастрит, індукований ASA у мишей. Як зброджене молоко, так і EPS здатні модулювати імунну відповідь у мишей і збільшують товщину шару шлункового слизу. Крім того, спостережувана терапевтична ефективність була подібною до омепразолу ®, комерційного препарату, який зазвичай застосовується для лікування гастриту.

Кисломолочне з штам-продуцент EPS S. thermophilus CRL 1190 та/або його EPS є потенційною природною альтернативою для профілактики та лікування пошкодження шлунку, пов'язаного з АСК.

EPS - це вуглеводні полімери, які природним чином виробляються деякими бактеріями, водоростями, дріжджами та грибами. Ці полімери широко використовуються в декількох галузях промисловості, в основному завдяки своїм загущаючим, текстуруючим і геліфікуючим властивостям.

Дослідження - це добре проведене дослідження.

Рецензент: Шаші Бала, доктор філософії, докторант, медичний факультет, LRB 270L, 364 Plantation Street, UMass Medical School, Вустер, Массачусетс 01605, США

S- Редактор Ван YR L- Редактор Cant MR E- Редактор Ma WH