Спорова стінка дріжджів дозволяє спорам пережити проходження через травний тракт Росії Дрозофіла

Афілійований відділ біохімії та клітинної біології, Університет Стоні Брук, Стоні Брук, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ нейробіології та поведінки, Центр розвитку генетики, Університет Стоні Брук, Стоні Брук, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ біохімії та клітинної біології, Університет Стоні-Брук, Стоні-Брук, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки

Елісон Е. Колуччо,
Рейчел К. Родрігес,
Моріс Дж. Кернан,
Аарон М. Нейман

Цифри

Анотація

У природі дріжджі піддаються хижацтву мухами роду дрозофіла. У відповідь на поживне голодування Saccharomyces cerevisiae диференціюється у сплячий тип клітин, який називають спорою, стійкою до багатьох видів стресу навколишнього середовища. Стійкість до навантаження спор обумовлена, головним чином, споровою стінкою, яка є більш складною, ніж вегетативна клітинна стінка. Тут ми повідомляємо, що спори S. cerevisiae виживають при проходженні через кишечник Drosophila melanogaster. Для цієї стійкості необхідні складові спорової стінки, які відрізняють її від вегетативної клітинної стінки. Аскоспори далеких споріднених дріжджів Schizosaccharomyces pombe також виявляють стійкість до травлення D. melanogaster. Ці результати дозволяють припустити, що основна функція дріжджової аскоспори - це тип клітини, спеціалізований для диспергування комахами-переносниками.

Цитування: Колуччо А.Е., Родрігес Р.К., Кернан М.Дж., Нейман А.М. (2008) Спорова стінка дріжджів дозволяє спорам вижити при проходженні через травний тракт дрозофіли. PLOS ONE 3 (8): e2873. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002873

Редактор: Родольфо Арамайо, Техаський університет A&M, Сполучені Штати Америки

Отримано: 18 березня 2008 р .; Прийнято: 15 липня 2008 р .; Опубліковано: 6 серпня 2008 р

Фінансування: Ця робота була підтримана грантом NIH GM072540 для A. M. N.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

За відсутності азоту та присутності неферментованого джерела вуглецю диплоїдні клітини дріжджів Saccharomyces cerevisiae зазнають мейозу, а отримані гаплоїдні ядра упаковуються у спори [1]. Спори - це спокійні клітини, які виявляють стійкість до різноманітних образів навколишнього середовища. Спори S. cerevisiae характеризуються товстою оболонкою або споровою стінкою, яка є більш обширною, ніж клітинна стінка вегетативних клітин, і ця спорова стінка має важливе значення для стійкості спор до стресового впливу навколишнього середовища [2]. Спорова стінка складається з чотирьох шарів різних полімерів [2]. Два внутрішні шари складаються переважно з маннопротеїнів та бета-глюканів, і вони подібні до стінок вегетативних клітин [3]. Третій і четвертий (найвіддаленіші) шари є специфічними для спор і складаються, відповідно, з хітозану та полімеру, що містить дитирозин [4], [5]. Посилена стійкість спори до багатьох напружень пояснюється цими двома шарами зовнішньої стінки [6], [7]. У геміаскоміцетових дріжджів, таких як спори Saccharomyces, зазвичай утворюються в наборі з чотирьох, що називаються тетрадами, які укладені в мішок, який називається аскусом [8].

Ниткоподібні гриби часто утворюють складні структури для сприяння розподілу вітром (безстатевих) конідіоспор або аскоспор [9], [10]. Дріжджі не утворюють таких структур, і припускають, що аскоспори є переважно формою виживання, а не формою розпорошення [9]. Доведено, що суперечки стійкі до лабораторних обробок, таких як вплив парів ефіру або температурний удар при 55 ° C [6], [11], проте доцільність цих обробок до стресів у природному середовищі незрозуміла. Використання дріжджів як джерела їжі видами дрозофілідів у дикій природі добре задокументовано [12]. Попередні лабораторні дослідження з S. cerevisiae та D. melanogaster вказують на те, що вегетативні клітини гинуть при проходженні через кишечник і що суперечки збільшують виживання, але це не було чітко визначено [13], [14]. Ми повідомляємо тут прямі докази того, що спори демонструють підвищене виживання щодо вегетативних клітин при проходженні через кишечник Drosophila melanogaster, і що мутації, що особливо впливають на стінку спор, знижують рівень виживання. Більше того, для опору потрібні шари, унікальні для спорової стінки. Ці дані свідчать про те, що аскоспори S. cerevisiae є клітинним типом, спеціалізованим для розповсюдження в навколишньому середовищі за допомогою векторів дрозофіли.

Результати

Спори стійкі до стресів, пов’язаних з хижацтвом

Оскільки вважається, що однією з функцій спор є забезпечення стійкості в навколишньому середовищі, ми дослідили виживання суперечка під час різноманітних процедур, що імітують природні стреси. У цьому аналізі спори порівнювали з вегетативними клітинами у дві фази росту: культури фазових логарифмів, що містять активно початкові клітини, та культури стаціонарної фази (рис. 1). Клітини стаціонарної фази забезпечують особливо хороше порівняння, оскільки, як і спори, вони є нескладеними, спокійними клітинами, але не мають зовнішніх шарів спорової стінки. Порівняно з клітинами логарифмічної фази, спори були більш стійкими до всіх стресових процедур. Однак клітини стаціонарної фази були настільки ж стійкими, як спори, до деяких стресових факторів, зокрема, ці стреси мали на меті імітувати погодні умови. Клітини стаціонарної фази були настільки ж компетентними, як спори, при переживанні повторних циклів заморожування та підвищеної осмолярності або з високим рівнем декстрози, або з сорбітом. Крім того, клітини стаціонарної фази були порівнянні зі спорами в якісних аналізах на виживання при десикації (дані не наведені).

Виживання вегетативних клітин із насиченої культури (Sat), культури логарифмічної фази (Log) або спор (Spo) після впливу різних стресів вимірювали, як описано в Методах. Для кожного стану було проведено щонайменше три незалежних експерименти та визначено середній відсоток виживання. На графіку коефіцієнт виживання суперечків визначали як 1, а також відносну виживаність вегетативних культур. Тонкі лінії представляють діапазон відносного виживання. Середній відсоток виживання спор за кожної умови становив: 40% декстрози, 60%; β-глюканаза, 244%; Оцтова кислота, 54%; NaOH, 23%; Ефір 52%; Заморожування/Відтавання 94%; 2М сорбіт, 76%; 42 ° C, 73%; 5М NaCl, 51%.

Спори виживають при проходженні через кишку дрозофіли

Щоб перевірити цю можливість, ми встановили аналіз кількісної оцінки виживання S. cerevisiae після прийому всередину та проходження через кишечник плодової мухи D. melanogaster. Повідомляється, що середня кишка комах має регіони як високого, так і низького рН [19], умови, які можуть вибирати спори над клітинами стаціонарної фази (рис. 1). Для нашого аналізу ми сконструювали штами, у яких ген TEF2, що кодує фактор подовження трансляції 2a, рясний цитоплазматичний білок, був позначений GFP. Цілі клітини цього штаму демонструють яскраву цитоплазматичну флуоресценцію (малюнок 2B). Дрозофілу голодували протягом шести годин, а потім поміщали в чашку Петрі з клітинами нерухомої фази або спорами, що несли репортер TEF2: GFP. На кришці чашки Петрі прикріплювали накладку на кришку. Через 18 годин накладку покриття поміщали на предметне скло і окремі екскременти (мухомори) візуалізували безпосередньо у флуоресцентному мікроскопі. Цілі клітини зберігали цитоплазматичну флуоресценцію, тоді як мертві клітини вже не були флуоресцентними. Цей аналіз дозволяє визначити кількість виживання клітин, і оскільки клітини були безпосередньо візуалізовані у фекаліях (frass), гарантує, що вони пройшли через кишечник, а не були перенесені на покрив з зовнішньої сторони мухи.

Рослинні клітини або спори штаму AN390 подавали до дрозофіли, і frass аналізували за допомогою DIC та флуоресцентної мікроскопії. А) ДВЗ-зображення вегетативних клітин перед прийомом всередину. Б) Флуоресцентне зображення клітин у А. В) ДВЗ-зображення мухового макухи з дрозофіли, що харчується вегетативними клітинами. Стрілка вказує на неушкоджену вегетативну клітину. D) Флуоресцентне зображення клітин у C. E) DIC-зображення спор перед прийомом всередину. F) Флуоресцентне зображення спор у E. G) DIC-зображення мухи зі спор, що живляться дрозофілою. H) Флуоресцентне зображення клітин у G. Шкала шкали = 5 мкм.

За допомогою мікроскопії з диференціальною інтерференцією (DIC) більшість клітин нерухомої фази у фрасі здаються привидами з неушкодженими стінками, що не містять вмісту (рис. 2С). Відповідно до цього, клітинам-привидам не вистачає цитоплазматичної флуоресценції (рис. 2D). На відміну від цього, більшість спор у фрассі здаються неушкодженими як ДВЗ, так і флуоресценцією, що вказує на те, що вони стійкі до травлення в кишці мухи (рис. 2G, H). Спори все ще згруповані в набори по три чи чотири, що свідчить про те, що спори з окремих asci, як правило, тримаються разом під час проходження. Однак в більшості випадків аскальний мішок відсутній, що вказує на те, що суперечки утримуються між собою міжспоровими містками, які з'єднують спорові стінки [20].

Для кожного стану знімки збирали з кількох мухових плям і відсоток виживання обчислювали як частку інтактних клітин, як судять за наявністю сигналу флуоресценції (табл. 1). Для клітин стаціонарної фази відсоток виживання в різних мухових клітинах коливався від таблиці 1. Кількість виживання клітин у фрасі.

Унікальні шари спорової стінки необхідні для виживання спор

Щоб вивчити, чи є стінка спор важливою для стійкості до травлення, досліджували штами, у яких відсутні DIT1, OSW1 або MUM3. DIT1 кодує фермент, необхідний для синтезу самого зовнішнього шару дитирозину спорової стінки, тоді як за відсутності OSW1 або MUM3 втрачаються як шари хітозану, так і дитирозин [21]. Фрасс від мух, що живляться спорами штаму dit1, демонстрував збільшену частку видимих спорових привидів, що знову добре корелювало із втратою цитоплазматичної флуоресценції у спорах (рис. 3B, D). Кількісне визначення показало, що спори dit1 були більш чутливими, ніж спори дикого типу, але все ще більш стійкі, ніж клітини стаціонарної фази, із середньою виживаністю 30%. Спори osw1 та mum3 виявилися навіть більш чутливими, ніж dit1, при цьому спорові привиди важко розрізнити, а клітинні уламки помітні у фрасі (малюнок 3F, H). Виживання цих штамів, кількісно визначене на основі зовнішнього вигляду ДВЗ, а не флуоресценції, становило лише 3% та 8% відповідно, порівняно із виживанням клітин дикого типу стаціонарної фази (табл. 1). У сукупності ці дані вказують на те, що шар дитирозину є важливим, а шари хітозану та дитирозину вкрай важливі для стійкості спор до травлення дрозофілою.

Спори, мутантні для dit1, mum3 або osw1, подавали дрозофілі, і frass аналізували за допомогою DIC та флуоресцентної мікроскопії. A) DIC-зображення спор dit1 перед вживанням. Б) DIC зображення спор dit1 у фрасі. Стрілка вказує на неушкоджену суперечку. Стрілка вказує на лізовану спору. C) Флуоресцентне зображення спор у A. D) Флуоресцентне зображення спор у B. E) DIC зображення спор mum3 до прийому всередину. F) DIC зображення спор mum3 після прийому всередину. G) DIC зображення спор osw1 перед вживанням. H) DIC зображення спор osw1 у фрасі.

Спори S. pombe протистоять травленню дрозофілою

Щоб визначити, чи стійкість до травлення була унікальною для спор S. cerevisiae, ми дослідили виживання вегетативних клітин та аскоспор віддалених споріднених дріжджів Schizosaccharomyces pombe. Спорова стінка S помби також більш складна, ніж її вегетативна клітинна стінка, і, подібно до спорової стінки S cerevisiae, забезпечує стійкість до органічних сполук [22] - [24]. Однак спорові стінки S. pombe за своїм складом відрізняються від S. cerevisiae; наприклад, хоча вони можуть містити хітозан, їм не вистачає дитирозину [22], [25], [26]. Як і у S. cerevisiae, вегетативні клітини S. pombe були чутливі до травлення дрозофілою, а суперечки демонстрували підвищене виживання (рис.4), хоча в обох формах S. pombe був дещо чутливішим, ніж S. cerevisiae, до травлення (табл. 1) . Ці результати свідчать про те, що стійкість до травлення є спільною рисою аскоспор дріжджів і підвищують ймовірність того, що S. cerevisiae може бути дещо краще пристосована для розпорошення D. melanogaster, ніж S. pombe.

Рослинні або спороносні клітини штаму YDM124 подавали до дрозофіли та аналізували мухомори за допомогою світлової мікроскопії. А) Вегетативні клітини перед прийомом всередину. Б) Вегетативні клітини у фрасі. Стрілка вказує на неушкоджену клітинку. В) Спори перед прийомом всередину. Г) Спори у фрасі. Стрілка вказує на неушкоджену суперечку. Стрілка вказує на лізовану спору.

Гени S. cerevisiae, необхідні для виживання в кишечнику

Якщо спорові стінки були спеціально пристосовані для стійкості до травлення, ми могли б очікувати, що знайдуть гени, необхідні для стійкості до травлення, але не необхідні для стійкості до інших стресів. Щоб вивчити цю можливість, ми перевірили штами дріжджів із колекції, видаленої для генів, транскрипційно індукованих під час спороношення [27]. Ця колекція раніше була проаналізована на наявність мутантів, що впливають на сегрегацію мейотичної хромосоми, утворення спор та стійкість до ефіру [21], [27]. Ми проаналізували 250 окремих штамів. Кожному штаму спорулювали і спори подавали дрозофілі. Через мінливість виживання спор дикого типу в різних мухоломах, багаторазові мухомори досліджували за допомогою DIC-мікроскопії для кожного мутанта, і виживання визначали кількісно, підраховуючи відношення інтактних до спор привидів. Усі штами, про які раніше повідомлялося, що мають дефекти у формуванні спор [27], були дуже чутливими до травлення. Подібним чином мутанти з раніше повідомленими дефектами спорової стінки [21], такі як osw1 та mum3, були чутливими до проходження через кишечник.

Нас особливо цікавили штами, у яких на попередніх екранах не було виявлено явних дефектів. Близько 20 таких мутантних штамів виявили низьку виживаність (+/TEF2: GFP: his5 +) та AN391 (MATa/ MATα ura3/ura3 his3/his3 TEF2: GFP: his5 +/TEF2: GFP: his5 + dit1: his5 +/dit1: his5 +) були побудовані шляхом перекреслення TEF2: GFP з тегом MATa штам [38] до гаплоїдів AN117-4B [39] та AN263-5A (як AN117-4B, плюс dit1: his5 +) на швидко спорулюючому тлі SK-1 [40] і перетинаючи отримані сегреганти. Описано штами mum3 та osw1 [27]. Штами дикого типу (NKY895) і dit1 (AN264), що використовуються для аналізів конкурентного виживання, також були описані в інших роботах [20], [41]. Штам S. pombe, YDM124 (h90), наданий Ден Макколлумом (U Mass Worcester).

Лікування стресу

Аналізи флуоресценції проходження через дрозофілу

Порівняльні аналізи виживання

Спороношену культуру дикого типу (NKY895) змішували з культурами тестерів: спороносні клітини dit1 (AN264), спори osw1 або клітини стаціонарної фази (AN117-4B). Усі спороносні культури мали> 80% asci. Щоб визначити вхідний раціон дикого типу: клітини-тестери, суміші титрували як на TRP (селективний для дикого типу), так і на ADE (селективний для штаму тестувальника). Змішані культури гранулювали, наносили на агар у 50-міліметровій чашці Петрі і вводили мух, як описано вище. Щоб зменшити забруднення, мух вирощували на стерильному середовищі яблучного соку протягом> 2 днів до експерименту. Після інкубації протягом ночі з кришки чашки Петрі видаляли кришку, розрізану навпіл, і перемішували в 1 мл води в конічній трубці об'ємом 15 мл. Серійні розведення знову висівали на середовища випадіння ADE та TRP для визначення титру штамів дикого типу та тестувальників. Поділ кінцевої точки дикого типу: співвідношення тестувальника на співвідношення у вихідній культурі дає розрахунок відносної ефективності виживання спор дикого типу, наведених у таблиці 2.

Подяка

Автори хочуть подякувати Дену Макколлуму (U Mass, Вустер) за штами S. pombe та багатьом членам Дріжджового центру Stony Brook за їх заохочення під час роботи.

Внески автора

Задумав та спроектував експерименти: MJK AMN. Виконував експерименти: AEC RKR AMN. Проаналізовано дані: AMN. Реагенти/матеріали/інструменти для аналізу, внесені: MJK. Написав папір: MJK AMN.