Серцево-метаболічні ефекти інгібіторів ВІЛ-протеази (Лопінавір/Ритонавір)

Кетлін М. С. Е. Рейскенс

1 Кардіо-метаболічна дослідницька група (CMRG), Відділ фізіологічних наук, Університет Стелленбоша, Стелленбош 7600, ПАР,

Таррін-Лі Фішер

Джонатан С. Шислер

2 Інститут серця Макаллістера, Кафедра патології та лабораторної медицини, Університет Північної Кароліни, Чапел-Гілл, Північна Кароліна, США,

Венді Г. О'Коннор

Арлін Б. Роджерс

Монте С. Вілліс

Сінція Планесс

3 Groupe d'Etude sur l'Inflammation Chronique et l'Obésité (GEICO), Plateforme CYROI, Université de La Reunion, Saint Denis de La Réunion, Франція,

Флоренс Боєр

3 Groupe d'Etude sur l'Inflammation Chronique et l'Obésité (GEICO), Plateforme CYROI, Université de La Reunion, Saint Denis de La Réunion, Франція,

Філіп Рондо

3 Groupe d'Etude sur l'Inflammation Chronique et l'Obésité (GEICO), Plateforme CYROI, Université de La Reunion, Saint Denis de La Réunion, Франція,

Еммануель Бурдон

3 Groupe d'Etude sur l'Inflammation Chronique et l'Obésité (GEICO), Plateforme CYROI, Université de La Reunion, Saint Denis de La Réunion, Франція,

М. Фадіель Ессоп

Задумав та спроектував експерименти: KMSER MFE. Виконував експерименти: KMSER TLF JCS WGO ABR CP EB PR. Проаналізовано дані: KMSER TLF MSW EB MFE. Реагенти/матеріали/засоби аналізу, що вносяться: ТПВ EB MFE. Написав папір: KMSER MFE.

Анотація

Вступ

Вірус імунодефіциту людини (ВІЛ) заразив понад 40 мільйонів осіб за останнє десятиліття, причому понад 5 мільйонів мешкають в Африці на південь від Сахари [1], [2]. Хоча високоактивна антиретровірусна терапія (HAART) збільшує тривалість життя та якість інфікованих осіб [3], [4], все більше акцентується на опосередкованих HAART метаболічних порушеннях [5] та її потенційному ризику серцево-судинних захворювань (ССЗ) протягом тривалого часу -термін.

Інгібітори протеази (ІП) є невід'ємною частиною HAART, а побічні ефекти включають розвиток дисліпідемії, тобто більшу продукцію тригліцеридів та ліпідів у плазмі разом із несприятливим холестериновим профілем [6] - [8]. Разом такі розлади викликають запалення, напружують міокард (9) і можуть потенційно передбачити наступ інсулінорезистентності (ІР) [10], [11] та серцеву дисфункцію (11). ІП також пов’язані з підвищеним ризиком інфаркту міокарда [13] та серцево-судинних патологій [14], [15], причому багато змін нагадують ішемічну хворобу [16]. Неясно, чи побічні ефекти метаболізму ІП незалежно та/або причинно-наслідкові пов'язані з серцево-судинними збуреннями. Більше того, ефекти ІМ як такі на серце в цьому контексті також недостатньо вивчені. Отже, основна увага приділяється визначенню ключових метаболічних та транскрипційних шляхів, які можуть опосередковувати індуковану ІП кардіо-метаболічну патофізіологію. Наприклад, нещодавно ми виявили, що щури, які піддавалися 8 тижнів лікування ІП, мали порушення серцевої діяльності [17]. Більше того, ВІЛ-інфіковані, які лікуються ІП, мають підвищену продукцію активних форм кисню (АФК) [18] - [20], що може спричинити активацію шкідливих шляхів передачі сигналів та клітинної смерті [21].

Матеріали і методи

Тварина модель

Лопінавір/ритонавір (Kaletra TM, Abbott Laboratories, Abbot Park IL) подрібнювали і розчиняли в 1% розчині етанолу (транспортного засобу) при рівноважному плазмовій концентрації людини (7,1 ± 2,9 мкг/мл), стерильно фільтрували і вводили в міні -осмотичний насос (Alzet, Купертіно, Каліфорнія). Самці щурів Wistar (180–220 г) отримували або: фіктивну хірургічну операцію (фіктивну), транспортний засіб або PI-вмісний насос протягом 8 тижнів (n = 8 на групу), як описано раніше [17]. Споживання їжі вимірювали щотижневим зважуванням їжі (у клітках) і виражали як середнє споживання їжі на щура. З усіма тваринами проводили обробку згідно з Керівництвом по догляду та використанню лабораторних тварин Національної академії наук (публікація NIH № 85–23, переглянута у 1996 р.) Та проводили за схваленням Комітету з етики тварин Університету Стелленбоша (Південна Африка).

Вихідна оцінка функції серця

Через 8 тижнів щурів евтаназували пентобарбітон-натрієм (10 мг/кг, в/в), а серця швидко вирізали, зважили і помістили в крижаний буфер Кребса-Хенселейта (KH) перед канюлюванням на перфузійній установці Лангендорфа, як описано раніше [17] . Канюляція та перфузія відбулися протягом 2) після віднімання фону та нормалізувались на β-актин або пляму Понсо для виправлення варіацій навантаження. Первинні антитіла (кролячі чи мишачі) купували у Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz CA) або Cell Signaling (Cell Signaling, Danvers MA) для використання у розведенні 1: 1000 з відповідними вторинними антитілами (проти кролика або проти -миші антитіла, зв’язані з HRP, при розведенні 1: 4000).

Оцінка окисного стресу міокарда

Активність супероксиддисмутази (SOD) (Enzo Life Sciences, Farmingdale NY) вимірювали в мітохондріальних препаратах (приготованих згідно з Boudina et al. [38]), дотримуючись інструкцій виробника. Аналіз активності каталази базується на властивостях ферменту каталази зменшувати перекис водню (H2O2) до кисню (O2) та води (H2O) [39]. Випробовували приблизно 80 мкг білкового лізату в 25 мМ трис-HCl (pH 7,5). Заготовки вимірювали при 240 нм безпосередньо перед додаванням 80 мкл H2O2 (10 мМ кінцевий) для початку реакції. Активність каталази визначали шляхом вимірювання зменшення поглинання H2O2 при 240 нм. Розкладання пероксиду водню є типом реакції першого порядку після концентрації H2O2, а константа швидкості K для загальної реакції визначається як:

Кожне вимірювання розглядали з 4 повтореннями, і дані виражали як каталітичну одиницю (U) на мг загального білка. Карбонілювання білка проводили на тканинах серця, як описано раніше [40].

Визначення активації неокислювального шляху

Коротко, зібрані тканини серця гомогенізували з модифікованим крижаним буфером RIPA, супернатант центрифугували двічі при 13 000 g протягом 10 хв при 4 ° C, потім зберігали при -80 ° C до подальшого використання. Ми застосували Вестерн-блот-аналіз, щоб визначити загальну експресію O-GlcNAc як маркер для активації міокарда HBP та концентрації метилгліоксалю для оцінки активації AGE шляху (OxiSelect ™ MG ELISA Kit; Cell Biolabs, Сан-Дієго, Каліфорнія). Похідні метилгліоксалю утворюються внаслідок неферментативної реакції відновлення вуглеводів, таких як глюкоза та карбонільні сполуки (гліцеральдегід) в реакції Майяра - продукти цієї реакції називаються AGE. Рівні MG розраховували за стандартною кривою і виражали як нмоль на мг білка. Аналіз PKC проводили із застосуванням методу, що базується на ІФА, як описано в інструкції з експлуатації набору (Enzo Life Sciences, Farmingdale NY). Активність PKC визначали із стандартної кривої та виражали як нг/хв/мл.

D-сорбіт, проміжний продукт поліольного шляху, вимірювали як індекс активації шляху. Рівні D-сорбіту вимірювали, як детально викладено в інструкціях комерційно отриманого набору (BioVision K 631-100, Mountain View CA). Ми розрахували концентрацію сорбіту (С) у зразках, використовуючи кількість зразка (нмоль) із стандартної кривої (Sa), використовуваного обсягу зразка (мкл) (Sv) та коефіцієнта розведення (D); C = Sa/Sv * D. Ми використовували модифікований протокол (EC 2.2.1.1) від Sigma Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі) для визначення активності транскетолази як маркера неокислювальної гілки шляху пентозофосфатного шляху (PPP). Коротко кажучи, 5-фосфат ксилулози та 5-фосфат рибулози перетворюються транскетолазою у присутності іонів магнію та тіаміну пірофосфату в 3-фосфат гліцеральдегіду та 7-фосфат седогептулози. Потім G 3-P додатково перетворюється за допомогою триосефосфат-ізомерази в дигідроксиацетонфосфат і з додаванням β-NADH та α-гліцерофосфатдегідрогенази з отриманням α-гліцерину фосфату та β-NAD, які слід вимірювати спектрофотометрично при 340 нм. Цей протокол був адаптований від de la Haba et al. (1955) [41].