Порушення метаболізму амінокислот і ТСА та прогресування серцево-судинної вегетативної нейропатії при цукровому діабеті 1 типу

Анотація

Вступ

Кілька факторів ризику відіграють важливу роль у розвитку МОЖ, включаючи хронічну гіперглікемію, тривалість діабету, гіпертонію, гіперліпідемію, хронічне запалення, окислювальний стрес і, нещодавно, мінливість глюкози (1,2,4,9). Хоча прогресування CAN запобігають за допомогою жорсткого контролю рівня глюкози при цукровому діабеті 1 типу (2,9) і, можливо, за допомогою комбінованих багатофакторних втручань при цукровому діабеті 2 типу (10), на сьогоднішній день не існує специфічних методів модифікації захворювання для CAN. Таким чином, глибше розуміння механізмів, що модулюють розвиток та прогресування CAN, має вирішальне значення як для оцінки ризику, так і для терапевтичних втручань.

порушення

Дизайн та методи дослідження

Предмети

Сорок сім суб'єктів із діабетом 1 типу та 10 здорових контрольних суб'єктів, які відповідають віку, були включені в 3-річне поздовжнє спостережне дослідження. Основними критеріями включення для хворих на діабет були вік 18–65 років; наявність діабету 1 типу із тривалістю діабету не менше 5 років; і відсутні ознаки мікросудинних ускладнень або неконтрольованої гіпертензії на початковому рівні. Перед тим, як взяти участь у дослідженні, у всіх випробовуваних було проведено електрокардіограму в спокої та результати бігової доріжки у звичайному режимі. Пацієнти з серцево-судинними захворюваннями в анамнезі були виключені з дослідження. Здорові суб’єкти контролю відповідали віку з нормальною вагою, нормальною толерантністю до глюкози та нормальним артеріальним тиском (АТ). Сорок досліджуваних із діабетом 1 типу завершили дослідження. Демографічні та антропометричні заходи були зібрані за допомогою анкет та фізичного обстеження; Зразки крові та сечі натще були отримані для вимірювання різних метаболічних параметрів, включаючи HbA1c, ліпідну панель та тести функції нирок. Інституційна комісія Університету Мічигану схвалила дослідження, і письмова інформована згода була отримана від усіх предметів.

Оцінки CAN

Стандартизовані оцінки CAN проводились з усіма суб’єктами після нічного голодування. Випробовуваних попросили уникати кофеїну та тютюнових виробів протягом 8 годин перед тестуванням та зберігати будь-які ліки (крім базального інсуліну) до завершення тестування CAN. Суб'єкти, які пережили гіпоглікемічний епізод після опівночі (глюкоза в крові ≤50 мг/дл [2,77 ммоль/л]) перед тестуванням, були переплановані. Записи електрокардіограми отримували в положенні лежачи на спині за допомогою фізіологічного монітора (Nightingale PPM2; Zoe Medical), а дані збирали під час дослідження спокою (5 хв) та під час декількох стандартизованих серцево-судинних автономних рефлекторних тестів, отриманих при темпі дихання (реакція RR на глибоке дихання дихання, маневр Вальсальви та постуральні зміни). Індекси CAN були отримані з використанням ANX 3.1 (ANSAR Medical Technologies), як описано раніше (22). Всі змінні CAN були оцінені для всієї когорти на початковому рівні та для 40 пацієнтів з діабетом 1 типу (із 47), які закінчили дослідження за 3 роки спостереження.

Заходи з результатів МОЖУТЬ

Наступні показники CAN були попередньо визначені як результати інтересів та проаналізовані: SD нормального інтервалу RR (SDNN), середньоквадратичні різниці послідовних інтервалів RR (RMSSD), відношення видиху до вдиху (E: I) під час глибокого дихання, Коефіцієнт Вальсальви (в середньому два міри), коефіцієнт 30:15, низькочастотна (НЧ) потужність (0,04–0,15 Гц), високочастотна (ВЧ) потужність (0,15–0,4 Гц) та НЧ/ВЧ у спокої та під час серцево-судинних вегетативних рефлекторних тестів.

Вимірювання метаболітів

Амінокислоти вимірювали після очищення та дериватизації 100-мкл зразків плазми за допомогою газової хроматографії – мас-спектрометрії (газовий хроматограф Agilent 6890N, з'єднаний з мас-спектрометром 5973 MSD), використовуючи модифікований набір EZ: faast (Phenomenex); норвалін використовували як внутрішній стандарт (16,20). Метаболіти ТСА екстрагували із 100 мкл плазми із сумішшю метанолу, хлороформу та води (8: 1: 1), що містять позначені ізотопом 13 С внутрішні стандарти цитрату, сукцинату, фумарату, малату, α-кетоглутарата, лактату та пірувату. . Аналіз рідинної хроматографії – мас-спектрометрії проводили на системі Agilent, що складається з 1260 ультраефективного модуля рідинної хроматографії у поєднанні з квадрупольним мас-спектрометром 6520 часу (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія). Дані обробляли за допомогою кількісного аналізу MassHunter, версія B.07.00. Метаболіти нормалізували з найближчим позначеним ізотопом внутрішнім стандартом і кількісно визначали за допомогою лінійних калібрувальних кривих (16).

Статистичний аналіз

Перевірка цілісності даних

Метаболомічні змінні досліджували на предмет доказів проблемного виявлення сигналу на основі аналізу основних компонентів, що базується на перевірці викидів рівня метаболітів та суб’єктів, періодичного ефекту та виявленості. Всі змінні перевіряли на нормальність, і проводили відповідне перетворення даних (природне перетворення журналу або інший масштаб), щоб задовольнити припущення про нормальність для різних використовуваних статистичних методів. Було проведено оптимальну нормалізацію даних та масштабування, щоб забезпечити відповідний формат даних для подальшого статистичного аналізу.

План аналізу

Відмінності в клінічних характеристиках, показниках CAN, метаболітах циклу ТСА та рівнях амінокислот між суб'єктами, що страждають на діабет 1 типу, та здоровими суб'єктами контролю аналізували за допомогою тесту Стьюдента t або точного тесту Фішера для безперервних змінних та тесту χ 2 для категоріальних змінних. Корекція Бонферроні була застосована для врахування кількох порівнянь. Коефіцієнт кореляції Пірсона використовували для оцінки взаємозв'язку між метаболічними проміжними сполуками (метаболітами циклу ТСА та амінокислотами) та параметрами CAN для виявлення сильних тенденцій у біологічному контексті, що було підтверджено з наступними моделями регресії, що враховують вплив клінічних змінних. Лінійна регресія була використана для прогнозування асоціації з базовими метаболітами та вихідними параметрами CAN та прогнозування показників CAN на 3-річному періоді спостереження. Зменшення розмірів за допомогою аналізу основних компонентів було використано для пояснення високої кореляції між біологічно пов’язаними метаболітами, а основний компонент, що враховує найбільшу дисперсію, був використаний для подальшого аналізу. Весь статистичний аналіз проводився за допомогою програмного забезпечення SPSS (версія 24; IBM Corp.).

Наявність даних та ресурсів

Набори даних, створені під час та/або проаналізовані під час поточного дослідження, можна отримати у відповідного автора за обґрунтованим запитом. Під час поточного дослідження жодних відповідних ресурсів не було створено та проаналізовано.

Результати

Базові клінічні характеристики, заходи метаболіту та заходи CAN у всіх учасників

У таблиці 1 наведено вихідні клінічні характеристики цієї когорти порівняно з 47 суб'єктами, які страждають на цукровий діабет 1 типу (61% жінок, 4% курців, що в даний час курсують, і середній вік ± SD 34 ± 13 років, тривалість діабету 13 ± 6 років та HbA1c 8 ± 1,2%) та здорових суб’єктів контролю за віком та статтю. Суттєвих відмінностей у вихідних характеристиках між пацієнтами з діабетом 1 типу та здоровими суб’єктами контролю не було, за винятком рівня глюкози в крові натще (153,7 ± 76 проти 86,2 ± 14 мг/дл відповідно; P = 0,007) та HbA1c, які були критеріями використовується для визначення групи з діабетом 1 типу. Випробовувані з діабетом 1 типу були трохи важчими, без ознак мікросудинних або макросудинних ускладнень на початковому етапі (відсутність ретинопатії, нормального рівня креатиніну в сироватці крові або мікроальбумінурії відповідно до плану дослідження). Хоча здорові суб'єкти контролю не отримували ліки, всі пацієнти з діабетом 1 типу були на інсуліні, і серед них 24 (51%) використовували безперервну підшкірну інфузію інсуліну за допомогою насоса, 7 (15%) отримували статини, 5 (11 %) отримували інгібітори АПФ (незважаючи на те, що в анамнезі не було діабетичної нефропатії), і жоден з них не застосовував β-блокатори. Не було відмінностей у будь-яких показниках CAN між суб'єктами, хворими на цукровий діабет 1 типу, та здоровими суб'єктами контролю на вихідному рівні (Таблиця 1).

Клінічна характеристика суб'єктів із діабетом 1 типу та здорових суб'єктів контролю

Сорок пацієнтів з діабетом 1 типу повернулися наприкінці 3 років для подальшого проведення CAN та лабораторних заходів (табл. 1). Під час спостереження не було значних змін у глікемічному контролі чи зміні їх АТ, ІМТ або контролю ліпідів. Однак відбулося значне зниження SDNN, що свідчить про погіршення CAN (P Переглянути цю таблицю:

  • Переглянути вбудований
  • Переглянути спливаюче вікно

Базові проміжні продукти циклу ТСА та амінокислоти у учасників дослідження

Кореляція метаболітів із показниками CAN при цукровому діабеті 1 типу на початковому рівні та трирічне спостереження

У таблиці 3 та на рис. 1 показані кореляційні зв'язки Пірсона між показниками вмісту CAN та базових рівнів метаболітів у учасників із діабетом 1 типу. На малюнку 2 показані кореляційні зв'язки Пірсона між початковим рівнем метаболітів та зміною показників CAN на початковому рівні та протягом 3-річного спостереження за значущими метаболітами за певним шляхом. Як спостерігалось, більш високі рівні базового фумарату були пов'язані з погіршенням базових параметрів CAN (SDNN, r = -0,46, P = 0,003; RMSSD, r = -0,40, P = 0,01; pNN50, r = -0,45, P = 0,003). Подібним чином, вищий базовий рівень цитрату був пов'язаний з гіршими вихідними параметрами CAN (RMSSD, r = -0,51, P = 0,003) (Таблиця 3). Тим часом нижчі рівні як амінокислот аспарагіну (SDNN, r = 0,42, P = 0,007), так і глутаміну (SDNN, r = 0,51, P = 0,001) позитивно корелювали з базовим SDNN. Кореляція всієї панелі метаболітів та всіх базових показників CAN представлена ​​в Додатковій таблиці 2. Орієнтовна швидкість клубочкової фільтрації (eGFR) та відношення мікроальбуміну до креатиніну в сечі не мають ніякого відношення до вихідного рівня, 3 року, або зміни показників CAN.

Співвідношення між вихідними та 3-річними параметрами CAN з базовими метаболітами та основними компонентами

В: Принципова схема змінених метаболітів, які асоціюються з параметрами CAN. Метаболіти, виділені в червоних овалах, збільшуються у пацієнтів з діабетом 1 типу і позитивно відносяться до вихідних SDNN і RMSSD, ті, що містять зелені овали, зменшуються у пацієнтів з діабетом і позитивно відносяться до SDNN і RMSSD на початковому рівні та при спостереженні [значення r за кореляцією Пірсона з вихідними параметрами CAN, представленими в дужках як (SDNN/RMSSD)], а в овалах, заповнених жовтим кольором, у суб'єктів, що страждають на цукровий діабет, і позитивно пов'язані з SDNN та RMSSD під час спостереження та різниця в SDNN та RMSSD від базового рівня та спостереження [значення r за кореляцією Пірсона до 3-річних параметрів CAN подальшого спостереження, представлених у дужках як (SDNN/RMSSD)]. OAT, орнітин амінотрансфераза; P5CS, пірролін 5-карбоксилатсинтетаза.

Базові рівні глютаміну та орнітину також корелювали з SDNN під час 3-річного спостереження (глутамін, r = 0,60, P = 0,005; орнітин, r = 0,45, P = 0,005) (таблиця 3 та рис. 1). Зв'язок вихідних рівнів глютаміну з вихідними SDNN та 3-річним спостереженням залишався значним навіть після корекції за роки діабету, історії куріння, вихідного рівня HbA1c, глюкози в крові, ІМТ, загального холестерину, співвідношення альбуміну та креатиніну в сечі та eGFR (P = 0,014 та P = 0,005, відповідно). Іншими словами, підвищений рівень цитрату та фумарату та знижений рівень глютаміну та аспарагіну на початковому рівні були пов'язані з нижчими рівнями SDNN на вихідному рівні, що свідчить про погіршення CAN. Взаємозв'язок з базовим вмістом глутаміну та орнітину з SDNN зберігався протягом 3-х років спостереження. Кореляція всієї панелі метаболітів та трирічні показники CAN представлені в додатковій таблиці 3.

Як спостерігається в таблиці 3, нижчі рівні вихідного орнітину були пов’язані з погіршенням кількох параметрів CAN від початкового рівня до 3-річного спостереження (SDNN, r = 0,37, P = 0,024; RMSSD, r = 0,466, P = 0,003; HF потужність, r = 0,342, P = 0,036; співвідношення 30:15, r = 0,353, P = 0,03; співвідношення E: I, r = 0,365, P = 0,024). Зв'язок вихідних рівнів орнітину зі зміною RMSD, співвідношення 30:15 та співвідношення E: I протягом 3 років залишався значним навіть після корекції віку, років діабету, куріння в анамнезі, ІМТ, вихідного рівня HbA1c, глюкози в крові, холестерину, відношення мікроальбуміну до креатиніну в сечі та коефіцієнт ШКФР). Кореляція всієї панелі метаболітів та зміна показників CAN представлені в додатковій таблиці 4.

Для пояснення тісної кореляції між багатьма метаболітами ми зменшили розміри груп подібних метаболітів на основі біологічного контексту, використовуючи аналіз основних компонентів. Ми виявили, що основний компонент, що представляє глутамін, аспарагін та α-кетоглутарат (анаплеротичний шлях/глюконеогенез), і основний компонент, що представляє глутамін та орнітин (синтез орнітину), як позитивно корелюють з базовим SDNN та 3-річним SDNN, що свідчить про погіршення показників CAN ( Таблиця 3). Подібним чином основний компонент, що представляє змінені метаболіти ТСА, цитрат, α-кетоглутарат та фумарат негативно корелюють з базовим рівнем SDNN. Отже, зміни метаболітів, пов’язані з параметрами CAN, є специфічними для певного шляху та виявляють систематичні зміни в структурі метаболітів (рис. 2).

Обговорення

Це перше дослідження, яке вивчає зв'язок між CAN та проміжними речовинами центрального вуглецевого метаболізму (метаболіти циклу TCA та амінокислоти), використовуючи цілеспрямований підхід метаболоміки. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що у пацієнтів з діабетом 1 типу були вихідні порушення в рівнях кількох амінокислот і нижчі рівні фумарату в плазмі порівняно зі здоровими суб'єктами контролю. Більш високі вихідні рівні метаболітів циклу TCA, таких як фумарат та цитрат, також були пов'язані з нижчими показниками SDNN при цукровому діабеті 1 типу, що вказує на погіршення заходів CAN. Крім того, нижчі рівні базового рівня глютаміну, пов’язані з нижчими показниками SDNN на початковому рівні та під час 3-річного спостереження, вказують на погіршення заходів CAN після коригування на інші традиційні фактори ризику. Подібним чином, вихідні рівні орнітину пов'язані зі змінами SDNN та RMSDD, виміряними під час 3-річного спостереження після коригування клінічних змінних.

Гіперглікемія, як правило, визнається рушійним фактором для більшості ускладнень діабету. У нашому дослідженні на асоціації метаболітів з показниками CAN не впливали одночасний вміст глюкози в крові в тій самій пробі та тривалий контроль рівня глюкози у крові у формі HbA1c. Збільшений потік глюкози може призвести до подальшого виробництва вдосконалених кінцевих продуктів глікування, поліолу, гексозаміну, протеїнкінази С та полі (АДФ-рибоза) полімерази. Окислювальний стрес, апоптоз та запалення також є наслідками вищезгаданого потоку (32). Діабетична глюкотоксичність разом із цими зміненими метаболітами ТСА може сприяти модифікації білка, що включає глікацію, карбонілювання, нітрування, цистеїнове S-нітрозилювання, ацетилювання, сумойлювання, ADP-рибозилювання, O-GlcNAcylation та сукцинілювання (33). На додаток до цього, сукцинат та інші похідні ТСА діють на специфічні рецептори та шляхи впливу на окислювальний стрес та запалення (34,35). Таким чином, збережені проміжні продукти циклу Кребса, які негативно асоціюються із заходами CAN, можуть спричиняти змінені посттрансляційні модифікації білка, зв’язування з рецепторами, окислювальний стрес та запалення при цукровому діабеті 1 типу.

І SDNN, і RMSSD є показниками варіабельності серцевого ритму в часі. Хоча ці показники корелюють, вони надають інформацію про різні аспекти автономної модуляції. Загальновизнано, що SDNN є широким показником як симпатичної, так і парасимпатичної модуляції ВСР, тоді як RMSSD в основному характеризує парасимпатичний ефект (43). При діабетичній CAN взаємодія між симпатичним/парасимпатичним тонусом і функцією є складною, і зміни в різних показниках можуть бути не повністю синхронізованими, причому зміни в одних заходах передують іншим. SDNN та RMSSD є дуже ранніми показниками CAN, і зміни в цих показниках зазвичай передують явним формам CAN на багато років. Враховуючи, що учасники, які брали участь у цьому спостережному дослідженні, не мали ознак ускладнень на початковому етапі (відповідно до плану дослідження), і, отже, перебувають на дуже ранній, доклінічній стадії CAN, можна спостерігати вибірковість у взаємозв'язку між певними показниками ВСР та специфічні метаболіти. Наші висновки можуть також запропонувати диференційовані механізми, що сприяють модуляції різних аспектів вегетативної нервової системи на ранніх стадіях захворювання, які можуть бути націленими.

Нижні вихідні рівні глютаміну та вищі вихідні рівні фумарату, цитрату та пірувату пов'язані з гіршими показниками CAN на вихідному рівні та, можливо, пов'язаними з дисфункцією вегетативного нерва. Рівні орнітину пов'язані з погіршенням показників CAN під час подальшого спостереження, можливо, вказуючи на ранню недостатність, пов'язану з причинно-наслідковим зв'язком. Цей чіткий зразок метаболітів може лежати в основі унікальних аспектів патофізіології наявності та розвитку CAN. Крім того, ці метаболіти можуть служити біомаркером для вегетативної дисфункції у хворих на цукровий діабет 1 типу та як результат у дослідницьких випробуваннях методів лікування ранньої CAN. Хоча ці закономірності є дуже інформативними, ці висновки потребують підтвердження у більшій незалежній когорті, що має адекватні можливості.

CAN є незалежним предиктором прогресування діабетичної хвороби нирок, і пацієнти з більш запущеною хронічною хворобою нирок також частіше мають CAN (5–7). Відповідно до плану дослідження, жоден з пацієнтів не мав доказів діабетичної хвороби нирок, про що свідчить нормальний рівень креатиніну та відсутність мікроальбумінурії. Крім того, не було зв’язку вихідного коефіцієнта ШКФ або співвідношення мікроальбуміну до креатиніну в сечі з показниками CAN на початковому рівні або в 3 році, або зі зміною CAN протягом періоду спостереження. Ні коефіцієнт коефіцієнта коефіцієнта шуму, ні коефіцієнт мікроальбуміну до креатиніну в сечі не зменшували взаємозв'язок між базовими метаболітами та показниками CAN. Отже, ми можемо обґрунтовано зробити висновок, що взаємозв’язок цих метаболітів та заходів CAN не залежить від функції нирок.

Інформація про статтю

Фінансування. Ця робота частково підтримується грантами Центру наукового огляду, Національного інституту охорони здоров’я (NIH) (P30DK081943, DK089503, DK082841, DK097153, K08HL130944 та 1R01HL102334-01) та гранту Американської діабетичної асоціації 1-14-MN-02 . Ця робота використовувала основні послуги, підтримані грантом DK097153 NIH Мічиганському університету.

Подвійність інтересів. Не повідомлялося про потенційні конфлікти інтересів, що стосуються цієї статті.