Порівняльна геноміка молочнокислих бактерій

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: koonin @ ncbi.nlm.nih.govtrk @ union.ncsu.edubcweimer @ cc.usu.edudamills @ ucdavis.edu

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: koonin @ ncbi.nlm.nih.govtrk @ union.ncsu.edubcweimer @ cc.usu.edudamills @ ucdavis.edu

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: koonin @ ncbi.nlm.nih.govtrk @ union.ncsu.edubcweimer @ cc.usu.edudamills @ ucdavis.edu

Внесені Т. Клаенхаммером, 16 серпня 2006 р

Анотація

Бактерії, що виробляють молочну кислоту, пов’язані з різними нішами рослин та тварин і відіграють ключову роль у виробництві ферментованих продуктів харчування та напоїв. Ми повідомляємо про дев'ять послідовностей геномів, що представляють філогенетичне та функціональне різноманіття цих бактерій. Невеликі геноми молочнокислих бактерій кодують широкий репертуар транспортерів для ефективного засвоєння вуглецю та азоту з середовищ, багатих на поживні речовини, в яких вони мешкають, і відображають обмежений спектр біосинтетичних можливостей, які вказують як на прототрофні, так і на ауксотрофні штами. Філогенетичний аналіз, порівняння вмісту генів у групі та реконструкція наборів генів предків вказують на поєднання великої втрати генів та придбання ключових генів за допомогою горизонтального переносу генів під час коеволюції молочнокислих бактерій з їх середовищами проживання.

Молочнокислі бактерії (LAB) історично визначаються як група мікроаерофільних грампозитивних організмів, які зброджують гексозний цукор, виробляючи переважно молочну кислоту. Ця функціональна класифікація включає різноманітні промислово важливі роди, включаючи види лактококів, ентерококів, енококів, педіококів, стрептококів, лейконосток та лактобактерій. Спрощений, здавалося б, метаболізм ЛАБ використовувався протягом історії для збереження продуктів харчування та напоїв майже у всіх суспільствах, що сягають витоків сільського господарства (1). Одомашнення штамів LAB, передане різними кулінарними традиціями, і постійне проходження по продуктам харчування призвело до того, що сучасні культури здатні здійснювати ці ферментації. Сьогодні LAB відіграють визначну роль у світовому постачанні продуктів харчування, виконуючи основні біоконверсії у ферментованих молочних продуктах, м’ясі та овочах. LAB також мають вирішальне значення для виробництва вина, кави, силосу, какао, закваски та численних корінних ферментацій харчових продуктів (2).

Види LAB є корінними для середовищ існування, пов’язаних з їжею, включаючи рослинне (фрукти, овочі та зернові культури) та молочне середовище. Крім того, LAB природним чином пов’язані із поверхнею слизової оболонки тварин, наприклад, тонкою кишкою, товстою кишкою та піхвою. Ізоляти одного виду часто отримують із рослинних, молочних та тваринних середовищ існування, що передбачає широке поширення та спеціалізовану адаптацію до цих різноманітних середовищ. Види LAB використовують два шляхи метаболізму гексози: гомоферментативний шлях, в якому молочна кислота є основним продуктом, і гетероферментативний шлях, при якому утворюються молочна кислота, СО2, оцтова кислота та/або етанол (3).

Повні послідовності геномів опубліковані для восьми ферментативних та коменсальних видів LAB: Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus salivarius thermo і Streptococcus 4-Stre11. У цьому дослідженні розглядаються дев'ять інших геномів LAB, що представляють філогенетичне та функціональне різноманіття мікроорганізмів, що продукують молочну кислоту. LAB мають невеликі геноми, що кодують цілий ряд біосинтетичних можливостей, що відображають як прототрофні, так і ауксотрофні ознаки. Філогенетичний аналіз, порівняння геномного вмісту по всій групі та реконструкція генетичних наборів предків виявляють поєднання втрати та посилення генів під час коеволюції LAB з тваринами та продуктами, які вони споживали.

Результати і обговорення

Загальні ознаки геномів LAB.

Основні особливості послідовних геномів LAB узагальнені в таблиці 1, яка опублікована як допоміжна інформація на веб-сайті PNAS. Кількість передбачуваних генів, що кодують білок, у LAB відрізняється від ≈ 1700 до ≈ 2800. З огляду на тісний філогенетичний взаємозв'язок цих організмів, така різниця свідчить про значну втрату генів та/або посилення їх еволюції. Крім того, всі геноми LAB містять псевдогени. Вражаюче, що кількість псевдогенів відрізняється на порядок від 75% значень початкового завантаження. Види забарвлені відповідно до поточної систематики: Lactobacillaceae, синій; Leuconostocaceae, пурпурові; Streptococcaceae, червоні.

Філогенетичні дерева Lactobacillales, побудовані на основі об'єднаних вирівнювань рибосомних білків. Усі гілки підтримуються при значенні завантаження> 75%. Види забарвлені відповідно до поточної систематики: Lactobacillaceae, синій; Leuconostocaceae, пурпурові; Streptococcaceae, червоні.

Молекулярний годинниковий тест (19) показав високу неоднорідність темпів еволюції в межах Lactobacillales. Більшість відстаней від коренів до верхівки значно нерівні середній висоті дерева; раніше повідомлене (20) прискорене еволюціонування групи Leuconostoc (у 1,7-1,9 раза в порівнянні з сестринською групою Pediococcus) було особливо помітним.

Силу очищаючої селекції, що діє на види Lactobacillales, можна оцінити, використовуючи дві тісно пов'язані пари геномів: Lb. gasseri/Lb. johnsonii та Lc. lactis/Lc. cremoris. Швидкості заміщення синонімів та несинонімів оцінювали на основі об'єднаних вирівнювань послідовностей кодування 443 ортологічних генів (142 031 кодонів). Співвідношення dS/dN (відстань на синонімічних сайтах/відстань на несинонімічних сайтах) становило 38,5 ± 0,5 для Lb. gasseri/Lb. пара Джонсоні і 29,8 ± 0,4 для Lc. lactis/Lc. пара креморисів, що демонструє надзвичайно сильний еволюційний тиск у порівнянні з протеобактеріями, які мають характерне співвідношення dS/dN 5–10 (21). Це, ймовірно, відображатиме великий ефективний розмір популяції та/або високий рівень мутації видів Lactobacillales, оскільки, як відомо, інтенсивність очищувального відбору пропорційна цим кількостям (22).

Скупчення ортологічних генів у лактобактерій.

Збережені та унікальні гени в геномах лактобактерій. "Гомолог" позначає гени з виявленими гомологами в організмах, відмінних від аналізованих тут, але не може бути включений в жоден з наборів COG. «Сироти» - це передбачувані гени без виявлених гомологів. Lacga, Lb. газсері; Lacbr, Lb. бревіс; Педпе, P. pentosaceus; Laccr, Lc. lactis ssp. креморис; Strth, S. thermophilus; Еное, О. оені; Леуме, Ле. мезентероїди; Лакка, Lb. казеї; Лакде, Lb. дельбрюцький; Лакла, Lc. лактис; Lacpl, Lb. плантарум; Lacjo, Lb. Джонсон. Вертикальна вісь показує кількість генів на геном.

Місцеві молекулярні годинники та HGT.

Реконструкція приросту та втрати гена в процесі еволюції лактобактерій.

Реконструкція змісту вмісту генів у Lactobacillales. Топологія дерева є такою, як на рис. 1, корінням якої є використання Baccillus subtilis як зовнішньої групи. Для кожного виду та кожного внутрішнього вузла дерева вказується передбачувана кількість присутніх LaCOG та кількість втрачених (синій) та отриманих (червоних) LaCOG уздовж гілки, що веде до даного вузла (виду). Скорочення наведені на рис. 2.

На додаток до зниження метаболізму, основну частину втрати генів у загального предка Lactobacillales виконували функції, пов'язані зі спороношенням, кодовані загальним предком Bacilli. Незважаючи на відсутність генів спороношення, каталази та інших ключових ферментів окисного стресу відповідь (наприклад, супероксиддисмутаза) у 8 з 12 аналізованих тут геномів (можливо, багаторазові втрати), принаймні деякі лактобактерії демонструють підвищену стійкість до стресу. Ця стійкість демонструється підвищеним відновленням живих лактобактерій з висушених у вакуумі та опромінених продуктів харчування (30) порівняно зі стафілококовими та сальмонельними видами. Ця стійкість може бути частково опосередкована низьким вмістом заліза, потужного окислювача, що супроводжується накопиченням марганцю, потужного антиоксиданту (31–33). Ймовірно, додатковий захист забезпечуватимуть інші антиоксиданти, включаючи глутатіон та γ-глутамілцистеїн. Деякі види Lactobacillus кодують біфункціональну глутатіонсинтетазу (GshAB), тоді як інші мають лише γ-глутамілцистеїнсинтетазу (GshA) (LaCOG01892). Однак навіть лактококи, які не можуть синтезувати глутатіон, накопичують його, мабуть, шляхом транспортування з навколишнього середовища (34).

Порівняння кількості генів, втрачених або отриманих на певній гілці дерева, та довжини відповідної гілки виявляє закономірність, подібну до описаної раніше для протеобактерій (43). Кількість генних втрат (навіть коли це нормується за розміром генома предків) сильно і суттєво корелює з довжиною гілок, визначеною з розбіжності послідовностей (R = 0,68; P −4), тоді як кількість генних прибутків (знову ж, незалежно від нормалізація) не виявляє такої кореляції (R = 0,16; P> 0,1). Годинна поведінка втрати генів узгоджується з великою кількістю дрібномасштабних подій, які випадковим чином розподіляються по шляху еволюції. Ця закономірність передбачає еволюцію при очищенні відбору. Навпаки, відсутність такої кореляції для збільшення гена, як видається, включає відносно великі партії генів, придбаних одночасно, з більшими інтервалами між подіями придбання, можливо, через позитивний відбір.

На додаток до реконструкції родових наборів генів, ми порівнювали геномні організації всіх послідовних геномів Lactobacillales з раніше розробленими обчислювальними методами (44). Лише тісно споріднені види показали значну колінеарність геному вище рівня окремих оперонів, і практично не було масштабного збереження генного порядку між чотирма основними групами лактобактерій (дані не наведені). Таким чином, процеси втрати та придбання генів під час еволюції цих бактерій супроводжувались великими перебудовами геному.

Філетичні моделі та реконструкція центрального обміну речовин.

Враховуючи значущість метаболізму цукру та систем перетворення енергії у Lactobacillales, ми вивчали еволюцію цих систем за допомогою філетичних моделей, відображаючи наявність або відсутність генів в окремих геномах способом, подібним до описаного в посиланні. 45. Більшість генів, що беруть участь у цих функціях, представлені у всіх видів (рис. 7 та таблиця 7, які опубліковані як допоміжна інформація на веб-сайті PNAS). Ці гени включають гени, що кодують нижчу частину гліколізу, від гліцеральдегіду-3Р до пірувату та перетворення пірувату в лактат та 2,3-бутандіол; утворення ацетату з ацетил-КоА; кілька реакцій пентозо-фосфатного шляху; і специфічна для манози система фосфотрансферази. Очевидно, що цих ферментів недостатньо для повного визначення метаболізму будь-якого окремого виду, і кілька реакцій характерні для окремих родових ліній. Характеристика присутності/відсутності ключових ферментів, що беруть участь у ферментації лактату, погано корелює з фенотипами лактобактерій (табл. 7). Однак було показано, що за певних умов лактобактерії можуть переключатися між власним виробництвом молочної кислоти та виробництвом змішаних кінцевих продуктів, включаючи оцтову кислоту, молочну кислоту, етанол та CO2 (46, 47).

Метаболічний потенціал лактобактерій доповнюється передбачуваними транспортними можливостями. Зокрема, системи поглинання амінокислот домінують над системами поглинання цукру та пептидів. Серед виявлених систем поглинання цукру, специфічних для олігосахаридів та глікозидів більше, ніж для вільних цукрів. Крім того, Lactobacillales кодують різноманітні передбачувані насоси для викидів ліків, пептидів та високомолекулярних потоків, деякі з яких, ймовірно, беруть участь у міжклітинній передачі сигналів.

Інші метаболічні можливості лактобактерій перераховані в таблиці 8, яка опублікована як допоміжна інформація на веб-сайті PNAS. Як правило, Lb. brevis, Lb. johnsonii, Lb. gasseri, Lb. delbrueckii та P. pentosaceus мають надзвичайно вузький репертуар біосинтетичних шляхів, тоді як Lc. lactis ssp. lactis, Lc. lactis ssp. cremoris, Lb. plantarum та Le. мезентероїди зберігають значно ширший біосинтетичний репертуар.

Бактеріоцини.

Заключні зауваження.

Порівняльний геномний аналіз, описаний тут, також пропонує перегляд таксономії лактобактерій. Філогенетичний аналіз множинних білкових послідовностей показав, що гілка стрептококів – лактококів є базальною в дереві Lactobacillales, а група Pediococcus є сестрою групи Leuconostoc, яка підтримує парафілію роду Lactobacillus. Крім того, Lb. casei впевнено розміщений біля основи Lb. дельбрюцької групи, що суперечить попередній класифікації.

Матеріали і методи

Послідування послідовності цілого геному було проведено в Інституті спільного геному Департаменту енергетики США. Геноми секвенували на глибину ≈8 × і збирали за допомогою Jazz, асемблера Joint Genome Institute (51). Закриття проміжків проводилось у Fidelity Systems, Inc., за допомогою прямого геномного секвенування (52).

ORF були ідентифіковані за допомогою програми GeneMarkS (53). Функції генів прогнозували шляхом присвоєння передбачуваних генів COG (www.ncbi.nlm.nih.gov/COG) за допомогою методу COGNITOR (24) та шляхом пошуку в базі даних, проведеного за допомогою програми PSI-BLAST (54). Передачу РНК передбачали за допомогою програми tRNAscan-SE (55). LaCOG були побудовані з використанням описаних раніше процедур (23, 56). Філогенетичний аналіз проводили із застосуванням методів найменшої квадратичної або максимально ймовірної ситуації, а сценарії посилення/втрати генів реконструювали за допомогою версії зваженого алгоритму парсимонізму (29).

Додаткові методологічні деталі та детальний перелік номерів депонування даних наведені в Додаткових матеріалах та методах, який опублікований як допоміжна інформація на веб-сайті PNAS.

Подяка

Виноски

↵ d Кому може бути адресована кореспонденція. Електронна пошта: kooninncbi.nlm.nih.gov, trkunity.ncsu.edu, bcweimercc.usu.edu або damillsucdavis.edu

Вклад автора: А. Слесарев, Е.К., Т.Х., Ф.Б., Й.Б., Р.Х., Д.О., Й.С., Г.У., М.С., Т.К., П.Р., С.К., Б.В. та Д.М. розроблені дослідження; К.М., А.Слесарев, А.Сорокін, Б.М., А.П., Н.Павлова, В.К., Н.Полоучин, В.Шахова, І.Г., Ю.Л., С.Л., К.Х., ДМГ, В.П., ДВ, Й.Х., Й.Г., К.Б., Дж. -HL, ID-M., BD, В. Смеянов, WW, R. Barabote, GL, EA, R. Barrangou, BG, YX, HR, DT, CP та SK виконані дослідження; А.П., Н.Павлова, Н.Полоучін, Б.Г., Ю.Х. та С.К. внесли нові реагенти/аналітичні інструменти; А. Слесарев, Y.W., A.P., V.K., I.G., D.R., A.B., G.L., E.A., R. Barrangou, F.B., J.B., R.H., D.O., J.S., G.U., M.S., T.K., P.R., S.K., B.W. і D.M. проаналізовані дані; та K.M., Y.W., E.K., T.K., P.R., S.K. та D.M. написав роботу.

Автори не заявляють конфлікту інтересів.

Зберігання даних: Послідовності, про які повідомляється в цій роботі, були депоновані в базі даних GenBank (номера приєднання CP000411 – CP000430).