Підвищення рівня вільних жирних кислот викликає запалення та погіршує судинну реактивність у здорових суб’єктів

Анотація

Щоб перевірити можливі гострі прозапальні ефекти жирних кислот, ми індукували збільшення концентрації вільних жирних кислот у плазмі крові (ВЖК) після інфузії ліпідів та гепарину протягом 4 годин у 10 здорових пацієнтів. Ми визначили активність зв’язування ядерного фактора κB (NF-κB) в мононуклеарних клітинах (MNC), субодиницю p65 NF-κB, генерацію активних форм кисню (ROS) за допомогою MNC та поліморфно-ядерні лейкоцити (PMN). Також вимірювали реактивність плечової артерії, використовуючи постішемічну дилатацію, опосередковану потоком. Активність зв'язування NF-κB в ядерних екстрактах MNC зросла до 163 ± 17% та 144 ± 14% порівняно з базальними рівнями через 2 та 4 год (P 2), які брали участь у дослідженні (табл. 1). Усі учасники мали нормальну толерантність до глюкози, не брали жодних ліків, мали нормальний артеріальний тиск та нормальний профіль ліпідів натще. Усі добровольці дали свою письмову, поінформовану згоду, і протокол дослідження був затверджений Комітетом з досліджень людини Державного університету Нью-Йорка в Баффало.

Протокол.

Учасники прийшли до клінічного дослідницького центру о 8.00 ранку, після нічного 12-годинного голодування. Катетер був введений в антекубітальну вену. Отримано вихідний зразок крові, і емульсію тригліцеридів (Liposyn, 10%; Abbott Laboratories, Північний Чикаго, Іллінойс) та гепарин (0,2 одиниці · кг -1 -1 хв -1) вливали зі швидкістю 50 мл/год протягом 4 год. Ми використовували меншу концентрацію ліпозину порівняно з більшістю попередніх досліджень, оскільки інфузія 20% ліпосину призводила до ліпемічної сироватки, де розділення МНК та ПМН було неможливим. Інфузію тригліцеридів припиняли через 4 години, а зразки крові відбирали через 0, 2, 4 та 6 годин. Судинну реактивність також вимірювали через 0, 2, 4 та 6 год. У двох різних випадках сім суб'єктів брали участь у двох інших дослідженнях, в яких протягом 4 годин вводили 0,9% нормального фізіологічного розчину або 5% декстрози, а зразки відбирали через 0, 2, 4 та 6 годин.

Ізоляція MNC та PMN.

Зразки крові відбирали у Na-EDTA як антикоагулянт. Загалом 3,5 мл зразка антикоагулянтної крові ретельно наносили на 3,5 мл середовища для ізоляції PMN (Robbins Scientific, Саннівейл, Каліфорнія). Зразки центрифугували при 450g в поворотному роторі протягом 30 хв при 22 ° C. В кінці центрифугування дві смуги відокремлювались у верхній частині гранул еритроцитів. Верхня смуга складається з MNC, а нижня - з PMN. Смугу MNC збирали піпеткою Пастера, неодноразово промивали збалансованим розчином солі Хенкса і відновлювали до концентрації 4 × 10 5 клітин/мл у збалансованому розчині солі Хенкса. Цей метод забезпечує вихід> 95% чистої суспензії МНК.

Вимірювання генерації АФК.

Аналіз зсуву електрофоретичної рухливості NF-κB.

Аналіз на затримку гелю NF-κB проводили, як описано раніше. ДНК-зв'язуючі білкові екстракти отримували з МНК методом, описаним Andrews et al. (15). Загальні концентрації білка визначали за допомогою аналізу білка BCA (Pierce, Rockland, IL). Аналіз на затримку гелю NF-κB проводили за допомогою набору для виявлення зв’язуючого білка NF-κB (Life Technologies, Лонг-Айленд, Нью-Йорк). Коротко кажучи, дволанцюжковий олігонуклеотид, що містить тандемний повтор консенсусної послідовності для сайту зв'язування NF-κB, був радіомаркірований γ-P 32 кіназою T4. Потім 5 мкг ядерного екстракту змішували з інкубаційним буфером, і суміш попередньо інкубували при 4 ° С протягом 15 хв. Додавали мічений олігонуклеотид (60000 cpm) і суміш інкубували при кімнатній температурі протягом 20 хв. Потім зразки наносили на лунки 6% неденатурирующего поліакриламідного гелю. Гель сушили під вакуумом і піддавали дії рентгенівської плівки. Денситометрію проводили за допомогою програмного забезпечення для молекулярного аналізу Bio-Rad (Геркулес, Каліфорнія).

p47 фокс-субодиниця, p65 (Rel A) та IκB та IKK-α та IKK-β Вестерн-блоттінг.

Вестерн-блот проводили, як описано раніше. Коротко, загальну концентрацію білка визначали за допомогою аналізу білка BCA (Pierce). Двадцять мікрограмів загальних гомогенатів використовували для SDS-PAGE. Вестерн-блоттінг проводили з використанням антитіла проти субодиниці p47 phox, придбаної в Transduction Labs (Сан-Дієго, Каліфорнія), та поліклональних антитіл проти NF-κB p65 (Rel A) або IκB (Rockland, Gilbertsville, PA) або IKK-α та IKK- β (Біотехнологія, Санта-Крус, Каліфорнія). Денситометричний аналіз вестерн-плям проводили за допомогою програмного забезпечення для молекулярного аналізу Bio-Rad.

Імунопреципітація IKK та аналіз кінази in vitro.

Вимірювання С-реактивного білка плазми, MIF, TNF-α, розчинної молекули внутрішньоклітинної адгезії-1, реакційноздатних речовин тіобарбітурової кислоти та білка-1 хемоаттрактанта моноцитів.

MIF плазми крові, моноцитарний хемоаттрактантний білок-1 (MCP-1), розчинна молекула внутрішньоклітинної адгезії (sICAM-1) та TNF-α аналізували за допомогою імуноферментних аналізів (ELISA) із систем досліджень та розробок (Міннеаполіс, Міннесота). Набір ELISA для С-реактивного білка (CRP) був придбаний у лабораторіях діагностичних систем (Webster, TX). Реакційні речовини тіобарбітурової кислоти (TBARS) вимірювали, використовуючи метод, описаний Yagi та співавт. (16).

Вимірювання FFA плазми, інсуліну та глюкози.

Рівні FFA вимірювали в плазмі, що містить ЕДТА та інгібітор ліпопротеїнліпази Параоксон (діетил-п-нітрофеніл-фосфат, 0,275 мг/мл крові; Sigma, Сент-Луїс, Міссурі) за допомогою колориметричного аналізу (Wako, Richmond, VA). Рівні інсуліну визначали за допомогою набору ІФА лабораторій діагностичних систем. Рівні глюкози вимірювали в плазмі за допомогою аналізатора глюкози YSI 2300 STAT Plus (Yellow Springs, OH).

Оцінка артеріальної реактивності плечової артерії.

Діаметр плечової артерії вимірювали за допомогою ультрасонографа Acuson 128XP/10 з високою роздільною здатністю з 7,5-МГц лінійним перетворювачем, як описано раніше (17). Передпліччя стискали на 40 мм вище систолічного артеріального тиску протягом 5 хв, а діаметр плечової артерії реєстрували через 15 с і знову через 45-60 с після ішемії. Судинну реактивність оцінювали через 0, 2, 4 та 6 годин.

Статистичний аналіз.

Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення SigmaStat (Jandel Scientific, Сан-Рафаель, Каліфорнія). Усі дані виражаються як середнє значення ± SD. Аналіз проводили за допомогою Kruskal-Wallis ANOVA за званнями. Метод Даннета використовувався для всіх численних процедур порівняння. Дані для генерації АФК МНК, ПМН та МІФ були логарифмічно перетворені. Тест підписаного рангу Вілкоксона був використаний для порівняння вазодилатації, що залежить від ендотелію.

РЕЗУЛЬТАТИ

FFA у плазмі крові, тригліцериди та концентрації інсуліну.

Концентрація FFA у плазмі зросла з 352 ± 62 мкмоль/л до 621 ± 59 мкмоль/л через 2 год, 732 ± 75 мкмоль/л через 4 год (P phox-субодиниця NADPH-оксидази в гомогенатах MNC, однак, не змінювалась під час інфузії (дані не відображаються).

Концентрації TBARS у плазмі та співвідношення TBARS/тригліцеридів.

Генерування АФК ПМН до та після інфузії ліпідів через 2, 4 та 6 год. Зверніть увагу, що генерація АФК значно зросла через 2 та 4 години.