Правила обмеження поживних речовин Золотистий стафілокок Метаболізм та адаптація ніш у носі людини

Міжфакультетський інститут мікробіології та інфекційної медицини, клітинна та молекулярна мікробіологія, Університет Еберхарда-Карла, Тюбінген, Тюбінген, Німеччина, Німецький центр досліджень інфекцій (DZIF), партнерський сайт Тюбінген, Тюбінген, Німеччина

Поточна адреса: біомолекулярна медицина, кафедра хірургії та раку, медичний факультет, Імперський коледж Лондона, Лондон, Великобританія.

Філіальний фармацевтичний інститут, Університет Ернст-Моріц-Арндт, Грайфсвальд, Грайфсвальд, Німеччина

Інститут мікробіології та інфекційної медицини, Мікробна генетика, Університет Еберхарда-Карла, Тюбінген, Тюбінген, Німеччина

Афілійований інститут тропічної медицини Тюбінгенського університету, Тюбінген, Німеччина

Поточна адреса: Інститут біохімії, Грайфсвальдський університет ім. Ернста-Моріца-Арндта, Грайфсвальд, Німеччина.

Афілійований фармацевтичний інститут, Грайфсвальдський університет ім. Ернста-Моріца-Арндта, Грайфсвальд, Німеччина

Бернхард Крисмер,
Мануель Лібеке,
Даніела Янек,
Мулугета Нега,
Марен Раутенберг,
Габріеле Горніг,
Клеменс Унгер,
Крістофер Вайденмаєр,
Майкл Лалк,
Андреас Пешель

Цифри

Анотація

Підсумок автора

Цитування: Krismer B, Liebeke M, Janek D, Nega M, Rautenberg M, Hornig G, et al. (2014) Обмеження поживних речовин керує метаболізмом золотистого стафілокока та адаптацією ніш у носі людини. PLoS Pathog 10 (1): e1003862. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003862

Редактор: Майкл С. Гілмор, Гарвардська медична школа, Сполучені Штати Америки

Отримано: 17 жовтня 2013 р .; Прийнято: 18 листопада 2013 р .; Опубліковано: 16 січня 2014 року

Фінансування: Цю роботу фінансував грант Німецького дослідницького фонду (DFG) грантами TRR34 для AP, CW та MLa; Міністерство освіти та досліджень Німеччини (SkinStaph, Menage) АП; стипендія Фонду Альфріда Круппа фон Болена Гальбаха: “Підхід функціональної геноміки в біології інфекцій” для MLi; та гранти від Німецького центру досліджень інфекцій CW та AP. Автори відзначають підтримку Deutsche Forschungsgemeinschaft та видавничого фонду з відкритим доступом Тюбінгенського університету. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Золотистий стафілокок є основною причиною інвазійних інфекцій людини - від поверхневих інфекцій шкіри та м’яких тканин до важких поширених захворювань, таких як сепсис та ендокардит [1]. S. aureus також є коменсалом людини та частиною мікробіоти у здорових людей, що полегшує доступ до стерильних тканин через відкриті рани та місця входу катетера. S. aureus можна виділити з різних поверхонь тіла людини, таких як глотка, пахвові западини та промежина, але його основною екологічною нішею та водосховищем, як відомо, довгий час є ніс людини [2] - [4]. На противагу цьому, коагулазонегативні стафілококи (CoNS), такі як Staphylococcus epidermidis, мають набагато менший потенціал вірулентності та використовують різні ділянки шкіри як основне середовище існування [5]. Основа стафілококового хазяїна та специфічність ніші залишаються невідомими.

Аналіз носової карети протягом тривалих періодів часу виявив три типи носіїв S. aureus [6]. Близько 20% людської популяції можна вважати неносіями, яких ніколи або лише у дуже рідкісних випадках не колонізують з низьким вмістом бактерій. На відміну від них, періодичні носії демонструють періоди чергування статусу неносія та колонізації різними штамами S. aureus. Кількість бактерій за одну ізоляцію може сильно змінюватися. Третя група приблизно 20% стійких носіїв характеризується наявністю S. aureus майже у всіх мазках з носа, як правило, при великій кількості бактерій і з одним специфічним штамом на людину з часом. Останнім часом пропонується розрізняти лише носіїв та неносіїв через подібну кінетику назальної елімінації S. aureus та профілі антистафілококових антитіл у переривчастих та не носіїв [7].

Результати

Носові секрети людини мають подібний склад у носіїв S. aureus та неносіїв

(A, B) Кількісне визначення метаболітів за допомогою ГХ-МС від восьми донорів зразків, мікромолярні концентрації наведені для сполук зі стандартними розведеннями, виміряними (A), для інших речовин відносна кількість вказана щодо внутрішніх стандартів (B). Верхня та нижня межі коробки та горизонтальні лінії в коробках представляють 25 і 75% процентилів та медіани відповідно. Вуса на ділянках вказують мінімальний і максимальний діапазон, додатково відображаючи дані. (C) Відмінності в профілях метаболітів у носових секретах від шести носіїв (схрещувань) та семи неносіїв (кіл), проаналізованих шляхом аналізу основних компонентів усіх рівнів метаболітів. Показано основний компонент 1 проти 2, що пояснює загалом 67,9% моделі PCA. Значення метаболіту були перетворені в журнал і масштабовані за одиничною дисперсією.

Щоб підтвердити спостережувані результати та дослідити потенційні відмінності між носіями S. aureus та неносіями, порівняно склад метаболітів у носових секретах із шести носіїв S. aureus та семи носіїв S. aureus. Структури метаболітів носіїв виявляли подібний ступінь варіації, як у неносіїв, але не мали суттєвої різниці між двома групами донорів для будь-якого з виявлених сполук (рис. 1С). Таким чином, статус переносника S. aureus у людини не пов’язаний із помітною різницею в назальному забезпеченні поживними речовинами, і метаболічна активність S. aureus, схоже, не має суттєвого впливу на загальну концентрацію метаболітів у носі.

Синтетичне носове середовище (SNM) дозволяє стабільно зростати S. aureus

(A), ріст S. aureus USA300 LAC та S. aureus Newman в SNM із збільшенням (у x разів) концентрацій амінокислот, органічних кислот та глюкози через 90 год зростання. Наведено середні значення та SEM для трьох незалежних культур кожної концентрації. (B) Ріст назальних ізолятів S. aureus (заповнені кола), S. epidermidis (трикутники) та інших коагулазонегативних стафілококів (CoNS) (відкриті кола) у рідкому SNM3 після зазначеного часу інкубації. Засоби в кожній точці часу відображаються горизонтальними лініями для кожної групи. Зазначені статистично значущі відмінності порівняно з S. aureus, розраховані за допомогою тесту ANOVA Крускала-Уолліса з пост-тестом Dunns та 95% довірчими інтервалами: *, p≤0,05; **, p≤0,01. Культури енергійно струшували при 37 ° С в А і В.

S. aureus краще пристосований до росту в SNM3, ніж CoNS

Для того, щоб перевірити здатність SNM3 моделювати умови життя стафілококів в носі людини, було виділено 87 різних штамів стафілококів з передньої нори 37 добровольців, а також зростання відповідних 18 S. aureus, 57 S. epidermidis та Порівняно 12 інших штамів CoNS (Staphylococcus capitis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus hominis) у SNM3.

(A) Серійні розведення всіх назальних ізолятів, вирощених у BM протягом ночі, були помічені на агарі BM або 3 × SNM (SNM3). Вісь y показує відсоток клітин, що утворюють колонії на SNM3, порівняно з BM. Вплив підвищених концентрацій поживних речовин у 5 ×, 10 × та 20 × SNM (B) або 10–100 мкМ метіоніну в SNM3 (C) на колонієутворюючу здатність аналізували з підмножиною штамів, зображених на малюнку 3A. S. aureus зображений у вигляді заповнених кіл, S. epidermidis - у вигляді трикутників, а інші коагулазонегативні стафілококи (CoNS) - у вигляді відкритих кіл. Турнік вказує медіану кожної групи штамів. Вказані статистично значущі відмінності, розраховані за допомогою тесту ANOVA Крускала-Уолліса з пост-тестом Dunns та 95% довірчими інтервалами: *, p≤0,05; **, p≤0,01; ***, p≤0,001.

Щоб дослідити, чи S. aureus просто краще пристосований до розбавлення концентрацій поживних речовин, ніж CoNS, відбір штамів, здатність яких утворювати колонії на SNM3 знаходився в середньому діапазоні, тестували на формування колоній на агарі SNM з трьома, п’ятьма, десятьма, і в двадцять разів концентровані поживні речовини. Як показано на малюнку 3B, концентрація поживних речовин у агарових пластинах SNM у десять-двадцять разів покращувала зростання більшості випробуваних S. epidermidis та деяких інших штамів CoNS, але лише деякі штами досягали подібних можливостей росту, як S. aureus, тоді як більшість колонії на кілька величин менші, ніж S. aureus, навіть при найвищих концентраціях поживних речовин. Таким чином, CoNS виявляється набагато менш здатним адаптуватися до розбавлених концентрацій поживних речовин, ніж S. aureus, і демонструє величезні внутрішньовидові зміни в їх здатності рости на агарі SNM3, навіть коли концентрація поживних речовин була сильно підвищена.

Експресія маркерних генів S. aureus у SNM3 подібна до такої у носі

Експресію генів аналізували методом qRT-PCR щонайменше для 6 незалежних культур, що ростуть в BM або SNM3, або в культурах BM у стаціонарній фазі (BM stat) кожна. Аналізовані транскрипти представляють RNAIII, фенолорозчинні модуліни β1 і β2 (psm), фактор злипання B (clfB), детермінант поверхні, регульований залізом A (isdA), і літичну трансглікозилазу (sceD). Верхня та нижня межі ящиків та горизонтальні лінії всередині ящиків представляють 25 і 75% процентилів та середніх значень відповідно. Вуса на ділянках вказують мінімальні та максимальні значення. Зазначені статистично значущі відмінності порівняно з БМ, розраховані за допомогою неспареного двостороннього t-критерію Стьюдента з корекцією Велча: *, p≤0,05; **, p≤0,01; ***, р≤0,001; ****, p≤0.0001.

Глобальна експресія гена S. aureus у SNM3 виявляє важливу роль анаболізму амінокислот під час колонізації носа

Культури S. aureus, вирощені за допомогою SNM3, дозволили нам контролювати глобальну експресію генів в умовах, що відображають колонізацію носа, і порівняти їх із профілями експресії з попередніх досліджень, в яких зазвичай використовували S. aureus, вирощену в складних середовищах. РНК від S. aureus USA300, активно зростаючи або в SNM3, або в BM, була гібридизована до мікрочипів Affymetrix та проаналізована щодо основних клітинних та метаболічних шляхів (дані зберігаються під номером приєднання GEO Series GSE43712). Багатофакторний аналіз даних був використаний, щоб показати відмінності або схожість між транскриптомними даними. Аналіз основних компонентів (PCA) підтвердив, що три біологічні повторення, виконані для кожного з двох умов, привели до дуже відтворюваних результатів, із суттєвими різницями в профілях транскрипції, отриманих за допомогою SNM3 або BM, і значення відображення PCA у 77,7% (рис. 5A).