Обмеження калорій пригнічує підписи транскрипції гіпокампа залежно від віку

Програма клітинної та молекулярної біології, Нью-Йоркський університет, Медичний центр Лангон, Нью-Йорк, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки, Центр досліджень Dementa, Інститут Натана Клайн, Оранджбург, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки

Affiliation Genome Technology Center, New York University Langone Medical Center, New York, New York, United States of America

Партнерський центр з досліджень Dementa, Інститут Натана Клайн, Оріндбург, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки, Департамент психіатрії, Медичний центр університету Нью-Йорка Лангоне, Нью-Йорк, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки

Affiliations Genome Technology Center, New York University Langone Medical Center, New York, New York, United States of America, Department of Pathology, New York University Langone Medical Center, New York, New York, United States of America

Програма клітинної та молекулярної біології, Нью-Йоркський університет, Медичний центр Лангоне, Нью-Йорк, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки, Центр досліджень Dementa, Інститут Натана Клайн, Оранджбург, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки, Департамент психіатрії, Нью-Йорк Університетський медичний центр Лангоне, Нью-Йорк, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки, Департамент нейронауки та фізіології, Нью-Йоркський університетський медичний центр Лангоне, Нью-Йорк, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки

Марісса Дж. Шафер,
Ігор Долгалєв,
Меліса Дж. Олдред,
Адріана Хегі,
Стівен Д. Гінзберг

Цифри

Анотація

Цитування: Schafer MJ, Dolgalev I, Alldred MJ, Heguy A, Ginsberg SD (2015) Обмеження калорій пригнічує залежність від віку транскрипційних підписів гіпокампа. PLOS ONE 10 (7): e0133923. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0133923

Редактор: Розалін М. Андерсон, Університет Вісконсіна, США

Отримано: 18 березня 2015 р .; Прийнято: 2 липня 2015 р .; Опубліковано: 29 липня 2015 р

Наявність даних: Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=ghitaeuqddoltyl&acc=GSE69952.

Фінансування: Це дослідження підтримали гранти Національних інститутів охорони здоров’я AG043375, AG014449, AG017617, GM007238, RR029893, TR000038 та Асоціації Альцгеймера (IIRG-12-237253).

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Дисфункціональні синаптичні зв’язки та нейродегенерація вважаються клітинними джерелами вікової залежності пам’яті та когнітивних порушень [1]. Формування гіпокампа, зокрема сектор гіпокампа CA1, є центральним центром навчання та пам'яті в мозку ссавців, який проявляє синаптичну пластичність, залежну від активності, у формуванні нейронних мереж [2]. Пірамідні нейрони CA1 сильно страждають при БА, тоді як кілька інших типів скроневої частки та клітин гіпокампа відносно пошкоджені протягом усього прогресування патології. Компіляція клітинних процесів, відповідальних за цю селективну вразливість, не повністю зрозуміла [3,4].

Регіон гіпокампа схильний до аномальної агрегації білка, що свідчить про порушення функції контролю якості протеомів протягом усього старіння [1]. При нормальному старінні гіпокампа, що характеризується харчуванням ad libitum (AL) і відсутністю явної патології, дефіцит просторової пам’яті збігається зі зниженням регуляції генів, що беруть участь у розгорнутій реакції білка, включаючи тепловий шок білка 5 кДа 5 (Hspa5) і кальретикулін (Calr) [5 ], а також негативна регуляція генів синаптичної пластичності [6]. Власні електричні та структурні характеристики пірамідних нейронів CA1 можуть також сприяти нейродегенеративній вразливості, де сприйнятливість до екситотоксичності може походити від зменшення буферної здатності кальцію в старшому віці щодо менш збудливих типів клітин [7,8]. Крім того, пірамідні нейрони CA1 залежать від передачі сигналів про виживання трофічного фактора, включаючи нейротрофічний фактор, що походить від мозку (Bdnf), і зменшення сигналізації трофічного фактора протягом усього старіння, яке відбувається збігається з втратою нейронів та порушенням пам'яті, також може сприяти селективному фенотип вразливості [9,10].

Матеріали і методи

Модель миші та приєднання тканин

Протоколи тварин для цього дослідження узгоджувались із керівництвом NIH та затверджувались Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC) Інституту Натана Клайн та Медичним центром Нью-Йоркського університету в Лангоні. Підмножина мишей, застосованих до цих експериментів, була використана як контрольна миша в нещодавно опублікованому дослідженні [16]. Приблизно у віці 2,5 місяців самкам швейцарських мишей Webster x DBA/C57BL6 F1 випадково призначали дієтичні режими AL або 30% CR (зменшення, характерне для вуглеводів) (AL, # D12450B; 30% CR, # D03020702B; Research Diets Inc., Нью-Брансвік, Нью-Джерсі). CR мишей годували щоденним розподілом вранці, а раціони CR коригували щотижня відповідно до середньодобового споживання групи AL. Ваги тіла вимірювали двічі на тиждень. Приблизно у віці 5 або 15 місяців, після 2,5 або 12,5 місяців дієти, відповідно, мишам вводили смертельну дозу кетаміну (80 мг/кг) та ксилазину (13 мг/кг), перфузірованную черезкардиально з крижаною 0,1 М фосфатний буфер, і мозок швидко видаляли. Жертвоприношення відбувалися в середині дня. Область CA1 гіпокампа мікродисекціювали з тканинних плит за допомогою розсікаючого мікроскопа, заморожували на сухому льоду і зберігали при -80 ° C, як було описано раніше [27].

Виділення РНК, підготовка бібліотеки та послідовність

РНК виділяли із заморожених мікродісекцій гіпокампа CA1 за допомогою мікроРНК miRNAeasy (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія) згідно з технічними характеристиками виробника. Для визначення концентрації та якості РНК застосовували біоаналіз (2100, Agilent Biotechnologies, Санта-Клара, Каліфорнія). 300 нг загальної РНК із середнім значенням цілісності РНК (RIN) 9 було застосовано до TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2 (Illumina, San Diego, CA) для побудови бібліотек секвенування мРНК. Якість бібліотек оцінювали за допомогою біоаналізу Agilent, а кількісну оцінку проводили за допомогою qPCR. Бібліотеки були застосовані до 8 запусків парного кінця 50-базової послідовності пар на платформі HiSeq 2500 (Illumina), використовуючи режим швидкого запуску. П’ять та шість біологічних повторень були послідовно розподілені за умовами дієти для груп 5 та 15 місяців відповідно.

Статистичний аналіз та функціональна анотація експресії генів

Базовий дзвінок здійснювався за допомогою програмного забезпечення Illumina bcl2fastq. Зчитування послідовності було вирівняно до генома миші (збірка UCSC mm10) за допомогою сплайсингу TopHat. Ймовірно, дублікати ПЛР були видалені за допомогою інструмента Picard MarkDuplicates. Відфільтровані зіставлені зчитування аналізували за допомогою пакета Cufflinks із параметрами за замовчуванням та наступними доповненнями. Для покращення точності оцінок чисельності транскриптів застосовували корекцію зміщення фрагмента, а для коректування зчитування ваги до кількох місць у геномі застосовували корекцію багаторазового зчитування. Використаним методом оцінки дисперсії було об'єднання за замовчуванням, при якому кожне відтворене умова моделювалось і усереднювалось, щоб забезпечити єдину глобальну модель для всіх умов. Диференціально експресовані гени визначали на основі скоригованого значення р-значення з урахуванням швидкості помилкового виявлення (FDR). Рис. 1. Середня маса тіла після тривалого годування CR або AL.

Починаючи приблизно з 2,5-місячного віку, самок мишей дикого типу дотримувались 30% дієт CR (фіолетовий) або AL (синій) і жертвували після 2,5 або 12,5 місяців дієти. Вагу тіла вимірювали приблизно двічі на тиждень. Протягом перших 2 тижнів годування AL та CR миші, які утримувались на 30% дієті CR, втрачали в середньому 12% своєї маси тіла (t-тест, p Рис. 2. Біологічна дисперсія в групах стану секвенування мРНК.

Квадратний коефіцієнт варіації (CV 2) був побудований на основі фрагментів на кілобазу екзону на мільйон відображених фрагментів (log10FPKM), що представляє загальний розподіл зчитуваних послідовностей іРНК для кожної групи умов, які зображені наступним чином, 5 місяців AL (корали), 5 місяців CR (зелений), 15 місяців AL (синій) і 15 місяців CR (фіолетовий).

Порівняння профілів експресії CA1 у мишей віком 15 місяців та мишей 5 місяців, які знаходились на контрольній дієті AL, виявило 2610 диференційовано регульованих транскриптів у межах log2-кратного діапазону змін від -4,98 до 6,98 (p Рис. 3. Диференціальна експресія генів за допомогою послідовності мРНК аналіз попарних порівнянь.

Вказується загальна кількість диференційовано виражених транскриптів, ідентифікованих загальним секвенуванням мРНК у кожному попарному порівнянні, разом із діапазоном log2-кратних змін (Log2FC) та кількістю регульованих (сірих) та регульованих вниз (білих) цілей (p Рис. 4. Long- термін CR протистоїть вікозалежним клітинним функціям і зворотно впливає на вікову експресію генів у секторі CA1 гіпокампа.

(A) Порівняльний IPA використовувався для прогнозування протилежних функцій, активованих (z-бал ≥ 2) або інактивованих (z-бал ≥ -2) протягом AL, 15 проти 5 місяців та 15 місяців, CR проти AL наборів даних. (B) 882 із 887 генних змін, загальних для нормального старіння (AL, 15 проти 5 місяців) та дієти CR у віці CA1 (15 місяців CR проти AL), відбуваються в протилежному напрямку. (C) Згладжене представлення щільності нормальних змін старіння (AL 15 місяців/AL 5 місяців) у порівнянні з дієтою CR у віці змін CA1 (CR 15 місяців/AL 15 місяців) для 887 генів, спільних для обох наборів даних, що ілюструє зворотну реакцію CR вікові зміни. (D) Теплова карта із зображенням 882 вікових змін експресії, придушених CR, порівнюючи середні значення log2-кратних змін кожного гена (p Таблиця 1. Канонічні шляхи, функціонально пов'язані з пригніченою CR-сигнатурою експресії у CA1 літнього дорослого гіпокампа.

(p Рис. 5. Посилення регуляції CR сигнатур нейропротективних генів зберігається через 5 і 15 місяців, незважаючи на різні транскрипційні профілі.