Новонароджений діабетичний щур Коен

Нонобезова нормоліпідемічна генетична модель діабету діабету 2 типу, що виражає статеві відмінності

Сара Векслер-Занген 12,
Хана Ягіль 1,
Девід Х. Занген 3,
Ашер Орной 2,
Говард Дж. Джейкоб 4 і
Йорам Ягіл 1

1 Лабораторія молекулярної медицини, Факультет наук про здоров'я, Університет Бен-Гуріона, Медичний центр Барзілай, Ашкелон, Ізраїль
2 Кафедра анатомії та клітинної біології Єврейського університету та Медичної школи Хадасса, Єрусалим, Ізраїль
3 Департамент педіатрії, Університетська лікарня Хадасса, Єрусалим, Ізраїль
4 Кафедра фізіології Дослідницький центр молекулярної та людської генетики, Медичний коледж штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Нонобезова нормоліпідемічна генетична модель діабету типу 2, що виражає статеві відмінності

Анотація

Хоча ця модель діабетичних щурів Коена була встановлена майже 30 років тому (16), до недавнього часу вивчалась лише обмежено. Основним недоліком цієї моделі було те, що її ніколи не систематизували з точки зору фенотипу чи генотипу, що призводило до лише обмеженого визнання її цінності та потенційного внеску у дослідження діабету. Ми взяли на себе завдання відродити модель, маючи на меті зробити її придатною для метаболічних, патофізіологічних та генетичних досліджень та зробити доступною для дослідників у всьому світі. Ми ініціювали програму вторинного виборчого інбридингу вихідної колонії для забезпечення максимальної фенотипової та генотипової однорідності відповідних штамів. Згодом ми вивчили фенотип отриманих штамів і, таким чином, вперше створили оновлену довідкову базу даних для цієї моделі. Ми також визначили генотип штамів, щоб перевірити генетичну однорідність, забезпечити відсутність перехресного забруднення між штамами, визначити ступінь поліморфізму ДНК між штамами та визначити інформативні маркери для майбутніх експериментів з схрещування. Ми надаємо детальну інформацію про фенотипи та генотип продуктів оновленого інбридингу.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Утримання тварин.

Тварин утримували по шість у клітці та розділяли за статтю, за винятком періодів розмноження. Під час вагітності та після розродження посліду самок утримували в окремих клітках. Витримувались дванадцятигодинні добові цикли світло-темряви. Кімнатну температуру підтримували між 22 і 25 ° C. Ці умови відповідають «Принципам лабораторного догляду за тваринами» (публікація NIH № 85–23, переглянута 1985 р.) Та рекомендаціям Американського товариства фізіологів щодо догляду за лабораторними тваринами.

Розведення колонії діабетичних щурів Коен.

Оригінальна колонія діабетичного щура Коена утримувалася з моменту її створення в приміщенні для тварин Єврейського університету та Медичної школи Хадасса в Єрусалимі, Ізраїль. Вторинний вибірковий інбридинг був розпочатий на місці 3 роки тому. Згодом частина отриманої колонії була переведена до приміщення для тварин в кампусі медичного центру Барзілай університету Бен-Гуріона в Ашкелоні, Ізраїль, де інбридинг продовжився. На обох ділянках проводились експерименти. Розведення, поводження з тваринами та експериментування отримали схвалення місцевих комітетів з питань догляду за тваринами обох установ.

Вибірковий інбридинг.

Оригінальні критерії відбору Коена базувались на пероральному тесті толерантності до глюкози з рівнем глюкози в крові (BGL) через 2 години> 180 мг/дл для діабетиків, чутливих до Коена (КД), і 230 мг/дл для КД та 125-мічених анти- антитіла до людського інсуліну (Medgenix, Брюссель, Бельгія) та немічений інсулін у різних концентраціях. Перехресна реакційна здатність з очищеним людським інсуліном (що використовується як стандарт) становила 90–95%.

Біохімія.

Рівень електролітів у плазмі крові, креатиніну та ліпідів визначали у 6-місячних знеболених (ксилазин/кетамін) тварин у крові, отриманій при роздвоєнні аорти. 24-годинну екскрецію білка з сечею визначали з сечею, зібраною в окремих клітинах метаболізму, за допомогою аналізу мікропреципітації білка.

Додаткові експерименти.

Тяжкість діабетичного фенотипу у CD-х чоловіків та статеві відмінності між самцями та самками CD-щурів, яких годували HSD, змусили нас провести два додаткові експерименти: один призначений для отримання проміжного робочого фенотипу, а інший - для вирішення проблеми можливий гормональний вплив на розвиток діабету у цього штаму.

Годування чергуванням днів.

Ми висунули гіпотезу, що низька маса тіла та явна неспроможність процвітати CD-чоловікам, яким було надано HSD, що відображає повномасштабний діабетичний фенотип, можуть бути викликані щоденним годуванням HSD з високим вмістом сахарози та відсутністю лікування інсуліном. стан, що симулює нелікований важкий діабет у людей. Ми вивчали цю гіпотезу на додатковій групі CD-щурів, яким HSD надавали лише в інші дні: періодичне годування (IF) замість щоденного годування (DF).

Гонадектомія.

Наша друга гіпотеза полягала в тому, що статеві гормони можуть враховувати статеві відмінності, що спостерігаються у фенотипі самців і самок CD щурів. Хірургічну гонадектомію або фіктивну операцію проводили у самців та самок CD щурів незабаром після відлучення, а тварин згодом годували або RD, або HSD. Контролем служили інтактні негонадектомізовані тварини. Характеристики росту відстежували в обох наборах експериментів, а ІПГТТ проводили у кожної групи тварин через 4 і 6 місяців.

Генотип.

Геномну ДНК проводили скринінг на прості поліморфізми довжини послідовностей серед репрезентативних тварин із CD і штамів CDr, використовуючи 550 мікросателітних маркерів (Research Genetics, Huntsville, AL), рівномірно розподілених по геному щурів. Раніше методи були детально описані (19,20). Коротше кажучи, геномну ДНК витягували з хвоста щура методом фенол/хлороформ. Цілісність, чистоту та кількість вилученої ДНК оцінювали за допомогою спектрофотометричної абсорбції (GeneQuant II; Pharmacia Biotech, Кембридж, Великобританія). Ланцюгову реакцію полімерази проводили на 50 нг геномної ДНК в кінцевому реакційному об’ємі 10 мкл, що містив 32 позначені Р-міченими парами праймерів, отримані від Research Genetics. Продукт кожної реакції (3 мкл) завантажували в поліакриламідний гель. Гелі запускали на апараті Base Ace (Stratagene, La Jolla, CA) і піддавали впливу плівки Kodak XAR-5 для авторадиографії. Посилення визначалося появою дискретних смуг. Гомозиготність була встановлена наявністю однієї дискретної смуги, що представляє інтерес для даного штаму, поліморфізм - появою диференціальної міграції продуктів ампліфікації для двох штамів, а гетерозиготність - одночасною появою двох смуг, що стосуються обох штамів.

Статистичний аналіз та управління даними.

Результати IPGTT аналізували за базовим рівнем (натщесерце), піком (максимальним) та 120-хвилинним BGL, а також за площею під кривою IPGTT (AUC). Дані представлені як середнє значення ± SE. Статистичний аналіз нормально розподілених даних проводився шляхом дисперсійного аналізу. Статистичне значення було встановлено на рівні Р 126 мг/дл через 6 місяців, і, таким чином, щури стали явно діабетичними.

Пік BGL.

У віці 5–6 тижнів максимальний вміст лімфоцитів у чоловіків та жінок CD та щурів CDr становив 210 мг/дл, із значно вищими рівнями у чоловіків, ніж у жінок (Таблиця 2).

BGL через 2 год.

У віці 5–6 тижнів BGL через 2 год після внутрішньочеревної ін’єкції повертаються до рівнів нижче 100 мг/дл у CD і самців CD та щурів CDr. У віці 4 та 6 місяців рівень ЛПН у щурів CDr (незалежно від дієти) та у щурів, що годували РД, також повертався до рівня нижче 100 мг/дл. Через 4 місяці в цих групах між статями не було різниці, але через 6 місяців рівень ЛПЖ був нижчим у жінок, ніж у чоловіків. У компакт-дисків щурів, яких годували HSD, рівень ЛПЖ через 4 і 6 місяців залишався помітно підвищеним, причому рівень нижчий у самок, ніж у самців (Таблиця 3).

У віці 5–6 тижнів AUC була однаковою у CD і самців CD та щурів CDr. Через 4 та 6 місяців AUC залишався незмінним у CDr щурів обох статей, незалежно від дієти, та у самок CD щурів, яких годували РД. У компакт-дисках обох статей, яких годували HSD, AUC була вдвічі або більше, ніж у щурів CDr, яких годували подібною дієтою, із значно нижчими значеннями у самок, ніж у чоловіків (табл. 4).

ЯКЩО експерименти.

ІФ призвів до проміжного діабетичного фенотипу у чоловіків CD та 4- і 6-місячних CD, з візерунком IPGTT, який був значно ослаблений порівняно з DF: BGL були нижчими натще, максимум та через 2 години; AUC була нижчою, ніж у щурів CD, яких годували щодня, але значно вища, ніж у щурів CDr, яких годували щодня або в інші дні (рис. 3).

Експерименти з гонадектомією.

Шаблон IPGTT у гонадектомізованих щурів показав дві фази (рис. 4). На ранній фазі через 4 місяці крива IPGTT не відрізнялася від кривої підроблених тварин як у самців, так і у самок, з помітно різними статевими відмінностями. Однак через 6 місяців крива IPGTT була надзвичайно ослаблена у чоловіків у порівнянні з фальшивою, із значно нижчим показником голодування, піком та 2-годинною BGL, а також AUC. У самок крива IPGTT через 6 місяців лише слабо пом'якшувалась гонадектомією, єдиною суттєвою відмінністю від підставних оперованих тварин був нижчий пік BGL. Отже, більше не було різниці в кривій між самцями і самками CD-щурів, яких годували HSD. Таким чином, статеві відмінності, що спостерігались у інтактних тварин, залишалися незмінними протягом ранньої фази розвитку діабету на 4 місяці, але були скасовані гонадектомією на пізній фазі через 6 місяців.

Рівень інсуліну в плазмі крові.

Оскільки в жодному з експериментів не виявлено різниці статей у рівнях інсуліну, надані дані поєднуються для чоловіків та жінок.

Інсулін натще.

У 4-місячних тварин, яких годували RD або HSD, рівень базального інсуліну натще був значно вищим у CD, ніж у щурів CDr (табл. 5). Оскільки БГЛ натощак були подібними, ці результати свідчать про гіперінсулінемічний стан у щурів з компакт-дисками. Рівні інсуліну як у CD, так і у CDr щурів були вищими у тварин, яких годували HSD, ніж за умови надання RD. У 6-місячних тварин більше не було різниці в рівні інсуліну натще між CD та щурами CDr, яких годували RD або HSD, хоча рівні глюкози та інсуліну, як правило, були вищими у щурів CD, яких годували HSD, хоча ні до статистично значущого рівня.

Реакція інсуліну на внутрішньочеревне навантаження глюкозою.

Рівень інсуліну через 15 хв після ін’єкції 1 г/кг глюкози внутрішньовенно. у 4-місячних CD-щурів щури, яких годували RD або HSD, були значно нижчими, ніж у щурів CDr, незважаючи на значно вищий рівень глюкози. Через 6 місяців спостерігалася подібна картина реакції на інсулін (табл. 5).

Біохімічні дані.

Біохімічні дані наведені в таблиці 6.

Плазмові електроліти.

Не було різниці в рівнях натрію, калію або хлориду в плазмі між CD і щурами CDr, яких годували як дієтою, так і між статями.

Ліпідний профіль.

Загальний рівень холестерину та ЛПВЩ був у межах норми у всіх досліджуваних групах, без чіткої закономірності розмежування штамів, дієти чи статі. Рівні тригліцеридів, хоча і знаходились у межах норми, були вищими, а рівні ЛПНЩ були нижчими в CD, ніж у щурів CDr у всіх, крім чоловіків, яких годували HSD.

Функція нирок.

Рівень креатиніну в плазмі коливався від 0,4 до 0,6 мг/дл. Не було відмінностей між CD та щурами CDr, незалежно від дієти та статі. Двадцяти чотиригодинна екскреція білка була 2 місяцями помірною гіперінсулінемією натще і наступним віковим зниженням їх здатності секретувати інсулін у відповідь на стимуляцію глюкози. Подібна порушена відповідь на інсулін також була описана у щурів GK (7,28). Можливим поясненням цих висновків є тривалий вплив гіперглікемії як такої, що вичерпує здатність секретувати інсулін підшлункової залози (13,17,18,28,29,30,31). Однак будь-які припущення щодо абсолютного дефіциту інсуліну в результаті повного виснаження β-клітин були виключені нашими результатами. Що стосується рівня інсуліну в плазмі крові, цікаво те, що ніяких статевих відмінностей не виявлено; таким чином, спостережувані відмінності в поводженні з глюкозою між самцями та самками CD-щурів, яких годували HSD, не можна було пояснити різницею в секреції інсуліну як такої.

На закінчення, продукти вторинного селективного інбридингу CD та штамів CDr виражають більш чіткі фенотипи, ніж оригінальні діабетичні фенотипи, описані Коеном. Сприйнятливість (чутливість або стійкість) до HSD виділяється як візитна картка цієї моделі. Статеві відмінності та роль чоловічих статевих гормонів потребують подальшого дослідження. Скринінг геному продемонстрував, що ця модель надзвичайно придатна для генетичних досліджень. Нарешті, це дослідження вперше пропонує детальний та уніфікований звіт про фенотипи, пов’язані з метаболічним діабетом, та генотип новоствореної колонії діабетичних щурів Коен - результат систематизованого контрольованого протоколу дослідження, який буде використовуватися як довідкова база даних для майбутні дослідження за цією моделлю.