Нова модель індукованої аденіном тубулоінтерстиціальної нефропатії у мишей

Тін Цзя

1 Відділ клінічної науки, втручання та технологій, Каролінський інститут, Стокгольм, Швеція

2 Renal Medicine and Baxter Novum, Karolinska Institutet, Стокгольм, Швеція

Ганнес Олаусон

1 Відділ клінічної науки, втручання та технологій, Каролінський інститут, Стокгольм, Швеція

Кароліна Ліндберг

1 Відділ клінічної науки, втручання та технологій, Каролінський інститут, Стокгольм, Швеція

Рісул Амін

1 Відділ клінічної науки, втручання та технологій, Каролінський інститут, Стокгольм, Швеція

Карін Едвардссон

1 Відділ клінічної науки, інтервенції та технології, Інститут Каролінської, Стокгольм, Швеція

Бенгт Ліндхольм

2 Renal Medicine and Baxter Novum, Karolinska Institutet, Стокгольм, Швеція

Геран Андерссон

3 Кафедра патології Інституту Каролінської, Стокгольм, Швеція

Анніка Вернерсон

1 Відділ клінічної науки, втручання та технологій, Каролінський інститут, Стокгольм, Швеція

Ів Саббах

4 Науково-дослідний центр Sanofi-Genzyme, Genzyme, компанія Sanofi, Фрамінгем, США

Сьюзен Скіаві

4 Науково-дослідний центр Sanofi-Genzyme, Genzyme, компанія Sanofi, Фрамінгем, США

Тобіас Е Ларссон

1 Відділ клінічної науки, втручання та технологій, Каролінський інститут, Стокгольм, Швеція

5 Нефрологічне відділення, Університетська лікарня Каролінської, Стокгольм, Швеція

Пов’язані дані

Анотація

Передумови

Моделі уремії in vivo є важливими інструментами для вивчення численних аспектів гострих та хронічних захворювань нирок. Моделі мишей мають вирішальне значення, оскільки більшість моделей генетично сконструйованих тварин - це миші, які дозволяють аналізувати вплив виділених цільових генів при нирковій недостатності. Протоколи на основі аденину для індукування ниркової недостатності доступні у щурів, але не були адаптовані у мишей через небажання споживати аденін. У цій роботі ми розробили новий метод індукції ниркової недостатності шляхом дієтичного введення аденину, змішаного в дієті на основі казеїну.

Результати

Після фази індукції була отримана стабільна модель ниркової недостатності (цільовий діапазон сечовини 80–100 мг/дл), що імітувала кілька аспектів хронічного захворювання нирок - розлади мінеральних та кісткових тканин, включаючи вторинний гіперпаратиреоз, аномалії кісток та патологічне підвищення рівня FGF23. Смертей не спостерігалося, і рівень уремії був адаптованим за допомогою регулювання вмісту аденіну, забезпечуючи значні переваги порівняно з існуючими моделями. У 8-тижневому дослідженні, що підтверджує концепцію, гістологія нирок показала головним чином пошкодження тубулоінтерстицію з інфільтруючими лейкоцитами, інтерстиціальний набряк та розширення простору Боунмена. Фіброз був присутній у більшості тварин, як визначено гістологією та змінами експресії генів маркерів фіброзу. Проліферація паратиреоїдних клітин була помітно збільшена, але без ознак гіпертрофії залози. Скелетна гістологія показала підвищене трабекулярне ожиріння кісток і кісткового мозку, тоді як кісткові біомаркери (CTX та PINP) припускають більш високе формування кісток, але, як не дивно, нижчу резорбцію кісток та порушення метаболізму.

Висновки

Ми представляємо новий, нехірургічний метод індукції ниркової недостатності у мишей. Це важливе доповнення до існуючих уремічних моделей для патофізіологічних досліджень при гострих та хронічних захворюваннях нирок, особливо з точки зору тубулоінтерстиціальних уражень.

Передумови

Хронічна хвороба нирок (ХБН) є глобальним тягарем для здоров’я [1], але в даний час ефективних методів лікування для її профілактики, прогресування та супутніх ускладнень бракує. Моделі ниркової недостатності на тваринах є важливими інструментами для вивчення патофізіологічних подій при захворюваннях нирок, що дозволяє проводити трансляційні дослідження, спрямовані на поліпшення ведення хворих на ХХН. Завдяки високій доступності генно-інженерних штамів мишей, уремічні моделі мишей дають можливість дослідити вплив конкретних генів-мішеней на встановлення ниркової недостатності.

Встановлені методи індукції ниркової недостатності у мишей здебільшого залежать від хірургічних втручань. Найпоширенішими методами, що застосовуються в даний час, є одностороння обструкція сечоводу [2-7], яка призводить до інтерстиціального фіброзу шляхом інфільтрації макрофагів і загибелі канальцевих клітин шляхом апоптозу та некрозу та 5/6 нефректомії [8,9]. Останній спосіб, як правило, передбачає дві окремі процедури, перші дві третини однієї нирки руйнуються електрокоагуляцією, а після одужання проводять контралатеральну нефректомію. Модель нефректомії 5/6 має кілька обмежень, включаючи значний рівень смертності при недостатньому виконанні, незворотність та фенотипічні зміни, пов’язані з хірургічною процедурою, а не з порушенням функції нирок [10]. Метод також пов'язаний із відносно великими варіантами між індивідуальними та міжлабораторними лабораторіями, і його доступність може бути порушена через відсутність хірургічної експертизи та відповідних операційних засобів.

Щоб обійти ці перешкоди, ми прагнули створити нову, нехірургічну модель ниркової недостатності у мишей, використовуючи протокол на основі аденина. Важливо, що існують добре охарактеризовані протоколи індукованої аденином ниркової недостатності у щурів, однак ця методика не була адаптована у мишей через їх неприязнь до годування аденином.

Методи

Експерименти на тваринах

Експерименти проводились відповідно до рекомендацій експериментів на тваринах Інституту Каролінської, а протокол дослідження був затверджений регіональним етичним комітетом (Південний етичний комітет Стокгольма, номер затвердження S184-10 та додаток S19-13). 8-тижневих мишей C57BL/6J утримували у стандартних клітках із підстилкою з деревної тріски та паперовим рулоном для збагачення при постійній температурі навколишнього середовища (21–22 ° C) та вологості (40-50%) з 12-годинним світловим циклом . Усі тварини мали вільний доступ до водопровідної води та призначений раціон. Перед початком дослідження всім мишам була дозволена акліматизація до умов тваринного господарства та чау-чау на основі казеїну протягом 7-денного періоду.

Щоб забезпечити аденінвмісну чау, споживану мишами, аденин змішували з дієтою на основі казеїну, яка притупляла запах і смак. Аденін був придбаний у Sigma Aldrich (MO, США), а порошкоподібна дієта на основі казеїну - у Special Diets Services (SDS, Великобританія) (контрольний номер 824522). Іншими інгредієнтами дієти є кукурудзяний крохмаль (39,3%), казеїн (20,0%), мальтодекстрин (14,0%), сахароза (9,2%), кукурудзяно-кукурудзяна олія (5%), целюлоза (5%), вітамінна суміш (1,0 %), DL-метіонін (0,3%) та бітартрат холіну (0,2%). Загальний вміст фосфатів становив 0,9%, а загальний вміст кальцію - 0,6%.

Дані, представлені в цьому документі, отримані з 8-тижневого експерименту з використанням 8-тижневих мишей дикого типу C57BL/6J. Щоб виключити можливість впливу дієти казеїну на одну порцію на функцію нирок, контрольну групу (n = 5) годували тією ж дієтою на казеїні, що і група аденина (n = 9), але без додавання аденина.

Біохімія сироватки та сечі

Кров збирали після серцевої пункції при жертвоприношенні та шляхом розрізу хвостової вени в проміжні моменти часу. Сечу відбирали у вигляді точкових зразків сечі після мимовільного сечовипускання. Рівні кальцію, фосфору, креатиніну та сечовини у сироватці та сечі вимірювали на Konelab 20XTi (Thermo Scientific, Фінляндія). Концентрації креатиніну перевіряли за допомогою колориметричного аналізу (BioChain, Каліфорнія, США), даючи майже однакові результати (rho = 0,95 та 0,98 для креатиніну в сироватці крові та сечі відповідно) у порівнянні з методикою Konelab. PTH вимірювали за допомогою інтактного набору ІФА мишей PTH (Immutopics, CA, USA), FGF23 з інтактним FGF23 ELISA (Kainos, Японія) та 1,25 (OH) 2D, CTX та PINP за допомогою наборів EIA (імунодіагностичні системи, Великобританія).

Гістологія

Нирки та паращитовидні залози фіксували у 4% формальдегіді, вкладали у парафін та розділяли за стандартними процедурами. Кістки декальцинировали в буфері, що містить 20% мурашиної кислоти. Усі тканини піддавались фарбуванню гематоксиліном та еозином. Зрізи нирок також фарбували на періодичну кислотну пляму Шиффа (PAS) для полісахаридів та слизових речовин (VWR International, Швеція), трихром (Ladewig) на м’язи та колаген (Histolab Products AB, Швеція) та von Kossa на мінералізовану тканину (VWR International), відповідно до інструкцій виробника. Нирки та кістки були оцінені сліпим способом досвідченим патологоанатомом нирок (AW) та кістковим патологоанатомом (GA), відповідно. Імуногістохімію проводили за стандартними протоколами з використанням кролячих моноклональних антитіл проти Ki67 (SP6 1: 400, Thermo Scientific, Каліфорнія, США) та кролячих антилюдських антитіл до мієлопероксидази (A398 1: 100, Dako, Данія). Індекс проліферації в паращитовидних залозах розраховували як кількість позитивних клітин Ki67, поділених на загальну кількість клітин у чотирьох послідовних секціях.

Алізарин червоний і кальцифікація судин

Грудну та черевну частини аорти (n ≥ 5 від кожної групи) розсікали, розщеплювали поздовжньо і клали рівно. Тканину інкубували з 1% розчином S-фарбування азариновим червоним (Alfa Aesar, Німеччина) при кімнатній температурі протягом 10 хвилин і тричі промивали 70% етанолом по 20 хвилин кожен.

Аналіз транскриптів нирок

Нирки гомогенізували за допомогою TissueLyzer LT (Qiagen, Нідерланди), а загальну РНК екстрагували за допомогою E.Z.N.A. Загальний набір РНК I (Omega Bio-tek, GA, США). ДНК видаляли за допомогою E.Z.N.A. Набір ДНКази без РНази (Omega Bio-tek). КДНК із першої ланцюга була синтезована за допомогою набору для синтезу кДНК iScript (Bio-Rad, Геркулес, Каліфорнія, США).

Для qPCR-аналізу в режимі реального часу використовували систему виявлення ПЛР у реальному часі та iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Відносну експресію гена розраховували за допомогою методу 2 -ΔΔ Cq, що нормалізує ген, що цікавить β-актин, у тій же пробі.

Статистика

Для статистичного аналізу використовували GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, Каліфорнія, США). Усі значення виражаються як середнє значення ± SEM, якщо не вказано інше. Відмінності між мишами, обробленими аденином, та контролями розраховували за допомогою непараметричного тесту Манна – Уітні. Значення Р 1. Дослідженню передувала 7-денна фаза адаптації казеїнової дієти без додавання аденіну і включала 10-денну фазу індукції (0–9 день) та підтримуючу фазу (10–56 день). На етапі підтримання вміст аденіну змінювався, як описано вище, в інтервалі 0,15-0,20%, щоб досягти бажаного рівня сечовини 80–100 мг/дл. Слід зазначити, що зниження концентрації аденину на 15 та 40 день з 0,2% до 0,15% призвело до швидкого зниження рівня сечовини та ПТГ. Однак довготривала оборотність та гістологічне покращення після відміни аденина не вивчались.

Схематичний вигляд 8-тижневого дослідження доказової концепції аденин-індукованої ниркової недостатності у мишей. Дослідженню передувала 7-денна фаза адаптації і включала 10-денну фазу індукції (0–9 день) та фазу технічного обслуговування (10–56 день).

Вага тіла та біохімія сироватки/сечі

Часові зміни маси тіла та маркери функції нирок зображені на малюнку 2 А. Під час фази індукції спостерігалося значне зниження маси тіла, але воно стабілізувалось і суттєво не змінювалось протягом фази підтримання. Згідно з попередніми повідомленнями, сечовина виявилася більш точним маркером уремії, ніж креатинін, тоді як співвідношення креатиніну/маси тіла було паралельним рівням сечовини [11]. Зниження співвідношення між сечею сечовина/сечовина сечовини та креатинін/креатинін сечі підтверджує знижений кліренс цих метаболітів (рис. 2 А). Важливо, що миші, що зазнали впливу аденіну, не мали підвищеної протеїнурії порівняно з контролем. Це, ймовірно, пояснюється відомою стійкістю штаму C57BL/6 до розвитку протеїнурії у поєднанні з тубулоінтерстиціальною природою пошкодження нирок у цій моделі [12].

Маса тіла та біохімічні показники під час дослідження. A: Вага тіла та параметри функції нирок під час дослідження. ΔТіла тіла (зверху): вага тіла знижувалася протягом 10-денної фази індукції в групі, яка отримувала аденин, але залишалася стабільною протягом фази підтримання до кінцевої точки. Маркери функції нирок: сечовина в сироватці крові, креатинін/маса тіла, сечовина/сечовина в сечі та креатинін/креатинін у сечі вказували на знижений рівень ниркового кліренсу у мишей, які отримували аденин. * p 2 B. Подібно до хворих на ХХН, у групи аденіну розвинулася значна гіперфосфатемія, вторинний гіперпаратиреоз та сильно підвищений FGF23, паралельно збільшеній екскреції фосфору з сечею [13]. Не спостерігалось змін у виведенні кальцію з сечею (р = 0,66 для вихідного рівня проти кінцевої точки). У кінцевій точці CTX значно знижувався, тоді як спостерігалося граничне значне збільшення PINP у мишей, які отримували аденин, порівняно з мишами на контрольній дієті, що свідчить про знижену резорбцію кісток, але посилене формування кісток (Рисунок 2 B).

Гістологія

Гістологічний аналіз нирок, паращитовидних залоз та кісток показаний на малюнку 3 A-C та у додатковому файлі 1: малюнок S1. Гістологія нирок показала перитубулярну лейкоцитарну інфільтрацію та інтерстиціальний/перитубулярний набряк, що відображає, що пошкодження нирок в основному є тубулоінтерстиціальним. Позитивне імунофарбування мієлопероксидази підтвердило, що перитубулярні лейкоцити в основному складаються з нейтрофільних гранулоцитів. (Додатковий файл 2: Рисунок S2). Збільшення простору Боумена спостерігалося в деяких, але не у всіх клубочках. Вогнищеві мікро-абсцеси були в деяких, але не у всіх зразках тканин, досліджених у групі аденінів. Короткий зміст гістопатологічних досліджень у нирках наведено в таблиці 1 .

Параметри атрофії канальців, залишків клітин/некротичного матеріалу та поліморфно-ядерних лейкоцитів (ПМН) у трубчастій просвітці, тиреоїдизація, інтерстиціальний фіброз та інтерстиціальне запалення оцінюються наступним чином: 0; вражає 0-5% ниркової області, 1; 6-25%, 2; 26-50% та 3; > 50%. Дані представлені як медіана (діапазон). Округлі кристалоїдні/аморфні структури в трубчастій просвітці, вогнищева дилатація та вогнищеві відкладення кальцію в канальцях оцінюються як наявні або відсутні. Морфологія судин оцінюється як патологічна або нормальна.

Визначення площі на серійних паратиреоїдних залозах не виявило явної гіпертрофії залози. І навпаки, швидкість проліферації паратиреоїдів, визначена за індексом Ki67, була збільшена (рис. 3 Б), і відповідно до підвищеного рівня ПТГ у мишей, які отримували аденин. Зрізи стегнової кістки показали розширені кісткові трабекули та підвищене ожиріння кісткового мозку, що відповідає сироватковому малюнку кісткових маркерів PINP та CTX. Забарвлення червоного алізарину не виявило явного кальцифікату судин в грудних аортах мишей, що зазнали впливу аденину (додатковий файл 3: Рисунок S3).

Зміни експресії генів місцевих маркерів запалення та фіброзу

Ми проаналізували рівні транскриптів ряду локально активованих генів, пов'язаних із запаленням нирок та фіброзом [14,15]. Маркери запалення Mmp3 (Ідентифікатор гена: 17392), Mmp9 (17395), Il7rα (16197), Ccl20 (20297) та Ccl5 (20304) були всі значно підвищені у мишей, які отримували аденин (рис. 4 A), тоді як Cxcr2 не змінювався ( дані не відображаються). Відповідні маркери фіброзу Tgfb1 (21803), Col1a1 (12842) та Ccl2 (20296) були суттєво підвищені у мишей на дієтичній дієті (рис. 4 B). Праймери, що використовуються для аналізу qPCR у реальному часі, представлені в додатковому файлі 4: Таблиця S1.

Експресія ниркових генів запалення та фіброзу. A) Маркери запалення Mmp3, Mmp9, Il7rα, Ccl20 та Ccl5 та B) Маркер фіброзу Tgfb1, Col1a1 та Ccl2 підвищували регуляцію у мишей, оброблених аденином. Відносна експресія генів у контрольній групі встановлена на 1. Білі смуги; контрольна група, чорні смуги; аденинова група. *** p (12M, pdf)

Позитивне імунофарбування мієлопероксидази підтвердило, що перитубулярні лейкоцити в основному складаються з нейтрофільних гранулоцитів.

Алізариновий червоний S-фарбування репрезентативних сегментів грудної аорти. У контрольних або мишей, які отримували аденин, не було виявлено кальцифікації судин.

Список праймерів, що використовуються для аналізу qPCR у реальному часі.

Подяки

Ми хотіли б подякувати Крістіні Хаммарштедт, Аннелі Ханссон, Марії Норгард та працівникам відділу тваринництва в АКМ6, Університетській лікарні Хаддінге, за їх цінну допомогу.

Розкриття інформації

Дослідження було ініційовано та проведено та підтримано науковими грантами Шведського фонду стратегічних досліджень, Шведської дослідницької ради (K2012-55P-22137-01-06), Шведського фонду нирок, Каролінського інституту та Університетської лікарні ім. YS та SS є працівниками компанії Sanofi-Aventis. TEL є неповним співробітником Astellas.