Нейропатія перед діабетом та ожирінням, спричинена дієтою

Ефекти “здорової” дієти та інгібування альдозоредуктази

Обросова Ірина Григорівна 1,
Ольга Ільницька 1,
Лизогубов Валерій Васильович 1,
Іван Павлов 1,
Назар Машталір 1,
Джеррі Л.Недлер 2 і
Віктор Р. Дрель 1

1 Пеннінгтонський біомедичний дослідницький центр, Університет штату Луїзіана, Батон-Руж, штат Луїзіана
2 Відділ ендокринології та метаболізму, Університет Вірджинії, Наукова система охорони здоров'я, Шарлотсвілль, Вірджинія

Зверніться до листування та запитів на передрук до Ірини Г. Обросової, доктора філософії, Біомедичний дослідницький центр Пеннінгтона, Університет штату Луїзіана, 6400 Perkins Rd., Батон-Руж, Лос-Анджелес 70808. Електронна пошта: obrosoigpbrc.edu

Ефекти “здорової” дієти та інгібування альдозоредуктази

Анотація

ЦІЛЬ -Суб'єкти, які страждають ожирінням і страждають від діабету, мають підвищений ризик розвитку як сповільнення нервової провідності, так і малих нейропатій чутливих волокон. Тваринні моделі цього типу невропатії не описані. У цьому дослідженні оцінено нейропатичні зміни та їх здатність до дієтичних та фармакологічних втручань у мишей, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру (HFD), моделлю переддіабету та аліментарного ожиріння.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ -Самку мишей C57BL6/J годували звичайними дієтами або HFD протягом 16 тижнів.

РЕЗУЛЬТАТИ—У мишей, що годувались HFD, розвивалося ожиріння, підвищена концентрація FFA та інсуліну в плазмі крові та порушення толерантності до глюкози. Вони також мали дефіцит рухової та сенсорної нервової провідності, тактильну аллодинію та термічну гіпоалгезію за відсутності внутрішньоепідермальної втрати нервового волокна або атрофії аксонів. Незважаючи на відсутність явної гіперглікемії, миші виявляли посилену активність шляху сорбітолу в периферичному нерві, а також накопичення 4-гідроксиноненального аддукту нітротирозину та полі (ADP-рибоза) та надмірну експресію 12/15-ліпоксигенази в нейронах гангліозних периферичних нервів та спинного кореня. . 6-тижневе годування нормальним чау після 16 тижнів на HFD полегшило тактильну аллодинію та суттєво виправило термічну гіпоалгезію та дефіцит сенсорної нервової провідності, не впливаючи на сповільнення провідності рухового нерва. Нормальна чау, що містить інгібітор альдозоредуктази фідарестат (16 мг · кг -1 день/-1), коригувала всі функціональні зміни індукованої HFD нейропатії.

ВИСНОВКИ -Подібно до людей, які страждають від діабету та ожиріння, у мишей, що харчуються HFD, розвиваються функціональні, але не структурні аномалії периферичного нерва, і, отже, є придатною моделлю для оцінки дієтичних та фармакологічних підходів до зупинки прогресування та зворотної діабетичної нейропатії на самій ранній стадії. захворювання.

ДРГ, ганглій спинного кореня
Харчова дієта з високим вмістом жиру
HNE, гідроксиноненальний
IGT, порушення толерантності до глюкози
MNCV, швидкість провідності рухового нерва
NEFA, нестерифікована жирна кислота
NT, нітротирозин
PARP, полі (АДФ-рибоза) полімераза
PDN, периферична діабетична нейропатія
SNCV, швидкість провідності сенсорного нерва
TBS, сольовий розчин, забуференний трис

Клінічна документація щодо нейропатії ожиріння та діабету диктує необхідність розробки адекватних тваринних моделей для вивчення патогенетичних механізмів та потенційних методів лікування. Недавнє дослідження (11) на жирових щурах Цукера характеризувало нейропатію до діабету та ожиріння, спричинену комбінацією спадкових та харчових факторів. Модель тварин з нормальним генетичним фоном та індукованим аліментарним ожирінням PDN, яка в ідеалі підходила б до досліджень дієти та способу життя, не описана. Тут ми наводимо докази того, що, як і у людей, що страждають ожирінням та ІГТ, у мишей, що харчуються жирним харчуванням (HFD), розвиваються функціональні, але не структурні аномалії периферичного нерва, і, отже, представляють підходящу модель для оцінки дієтичних та фармакологічних підходів до зупинка прогресування та зворотна діабетична нейропатія на самій ранній стадії захворювання. Основні метаболічні відхилення, які раніше вносили свій внесок у PDN [підвищена активність шляху сорбітолу, окисно-нітрозативний стрес, активація полі (ADP-рибоза) полімерази [PARP] та надмірна експресія 12/15-ліпоксигенази] ідентифікуються на стадії IGT, до розвиток гіперглікемії натще.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Реагенти.

Наркоз, евтаназія та відбір проб тканин.

Тварин заспокоювали CO2 (12) і негайно вбивали при вивиху шийки матки. Один сідничний нерв від кожної миші (16-тижневий момент часу) швидко розсікали і заморожували у рідкому азоті для подальшої оцінки проміжних концентрацій шляху сорбітолу та експресії 12/15-ліпоксигенази. Ще один сідничний нерв, ганглії спинного кореня (DRG) та подушечки ніг були зафіксовані у звичайному забуференному 4% формаліні. Сідничний нерв та DRG використовували для оцінки NT, аддуктів 4-HNE, полі (ADP-рибози) та 12/15-ліпоксигенази за допомогою імунофлуоресцентної гістохімії. Аддукти NT та HNE є загальноприйнятими змінними пероксинітрит-індукованої травми та перекисного окислення ліпідів (слід окисного стресу) відповідно. Накладки на ноги використовували для оцінки внутрішньоепідермальної щільності нервових волокон. Гомілкові нерви були зафіксовані (див. Нижче) і згодом використовувались для оцінки діаметра мієлінованого волокна та товщини мієліну. Сідничні нерви 22-тижневих щурів лікували подібним чином і використовували для оцінки змінних, описаних вище.

Фізіологічні тести.

MNCV сідничного нерва та цифровий SNCV задньої кінцівки вимірювали, як описано раніше в іншому місці (13). У всіх вимірах температуру тіла контролювали ректальним зондом і підтримували на рівні 37 ° C за допомогою зігріваючої подушечки. Температуру шкіри задніх кінцівок також контролювали термістором і підтримували від 36 до 38 ° C за допомогою променистого тепла.

Тести поведінки

Тактильні відповіді.

Теплова алгезія.

Щоб визначити чутливість до шкідливого тепла, щурів поміщали в камеру з оргскла на прозору скляну поверхню і давали їм кліматизуватися щонайменше 20 хв. Було використано вимірювач термічної стимуляції (комбінований вимірювач хвоста та хвороби лапки IITC моделі 336 TG). Пристрій активували після розміщення стимулятора безпосередньо під підошовною поверхнею задньої лапи. Була зафіксована затримка відведення лапи у відповідь на променеве тепло (інтенсивність 15%, що призвело до швидкості нагрівання ~ 1,3 ° C за с, час відсікання 30 с). Температуру підлоги було встановлено на рівні ∼32–33 ° C (установка виробника). Індивідуальні вимірювання повторювали чотири-п’ять разів і розраховували середнє значення.

Імуногістохімічні дослідження.

Усі розділи були оброблені одним слідчим і сліпо оцінені. Первинні антитіла були пропущені в негативному контролі. Спостереження за шкірними зрізами, забарвленими для PGP 9.5, проводили за допомогою мікроскопа Zeiss Axioskop. Кольорові зображення були зроблені камерою із зарядженим пристроєм Zeiss Axiocam HRc із роздільною здатністю 1300 × 1030. Зображення малої потужності генерувались із об'єктивом 40 × acroplan за допомогою функції автоматичного захоплення програмного забезпечення Zeiss Axiovision (версія 3.1.2.1). Спостереження малої потужності ділянок сідничного нерва та ДРГ, пофарбованих для аддуктів HNE, NT та полі (ADP-рибози), проводили за допомогою візуалізаційного мікроскопа Zeiss Axioplan 2. Кольорові зображення були зроблені за допомогою фотокамери із зарядженим пристроєм Photometric CoolSNAPHQ із роздільною здатністю 1392 × 1040. Зображення малої потужності генерувались із об'єктивом 40 × acroplan за допомогою програмного забезпечення RS Image 1.9.2.

Імунореактивність NT, аддукту HNE та 12/15-ліпоксигенази в нейронах сідничного нерва та DRG.

Полі (АДФ-рибоза) імунореактивність.

Імунореактивність полі (ADP-рибози) оцінювали, як описано раніше (13), з незначними модифікаціями. Коротше кажучи, зрізи депарафінізували в ксилолі, гідратували у знижуючих концентраціях етанолу і промивали у воді. Неспецифічне зв’язування блокували за допомогою реагенту, що блокує IG миші, що постачається з Vector M.O.M. Основний комплект імунодетекції. Потім мишаче моноклональне анти-полі (ADP-рибоза) антитіло розводили 1: 100 у 1% BSA у забуференному трис фізіологічному розчині (TBS) і наносили на ніч при 4 ° C у камері вологості. Вторинне антитіло проти миші кози Alexa Fluor 488 розводили 1: 200 в TBS і застосовували протягом 2 год при кімнатній температурі. Секції були змонтовані в подовженому золотому антиагрегатному реагенті. Було досліджено принаймні 10 полів кожного розділу, щоб вибрати одне репрезентативне зображення. Репрезентативні зображення мікрофотографували, а кількість полі (АДФ-рибоза) -позитивних ядер в сідничних нервах та DRG розраховували для кожної мікрофотографії. Для оцінки полі (ADP-рибози) імунофлюоресценції в нейронах DRG інтенсивність нейронального фарбування оцінювали від 1 до 3. Кількість нейронів DRG зі слабкими (ступінь 1), помірними (ступінь 2) та інтенсивними (ступінь 3) полі (ADP-рибоза) імунофлуоресценція була розрахована як відсоток від загальної кількості нейронів DRG, що демонструють імунофлюоресценцію полі (ADP-рибоза).

Внутрішньоепідермальна щільність нервових волокон.

Морфометрія великогомілкового нерва.

Морфометрію великогомілкового нерва проводили, як описано раніше (18). Тібіальні нерви фіксували протягом ночі при 4 ° C у 2,5% глутаральдегіді, забуференному 0,05 ммоль/л какодилату натрію (pH 7,3). Фіксовані зразки постфіксували в 1% тетроксиду осмію та зневоднювали через зростаючу серію концентрацій етанолу. Фіксовані нерви були вбудовані в епон і полімеризовані. Поперечні нервові зрізи семітину товщиною 1 мкм фарбували толуїдиновим синім. Для морфометричного аналізу діаметр мієлінованого нервового волокна та товщину мієліну вимірювали при збільшенні × 1600 за допомогою автоматизованої системи аналізу зображень (сканер NIH Image та Agfa Arcus, підключений до Macintosh Quadra 700, Купертіно, Каліфорнія), як описано раніше ( 18).

Біохімічні дослідження

Проміжні проміжки шляху сорбіту.

Концентрації глюкози, сорбіту та фруктози в сідничному нерві оцінювали спектрофлуорометрично за допомогою ферментативних процедур з гексокіназою/глюкозо-6-фосфатдегідрогеназою, сорбітолдегідрогеназою та фруктозодегідрогеназою, як описано раніше (12).

Вестерн-блот-аналіз експресії білка 12/15-ліпоксигенази.

Статистичний аналіз.

Результати виражаються як середнє значення ± SE. Дані піддавали випробуванню на рівність дисперсії F, а потім, при необхідності, перетворювали журнал перед одностороннім ANOVA. Де загальна значимість (Р 0,45 та Р> 0,09 порівняно з мишами, яких годували стандартною мишкою, відповідно); однак концентрація глюкози в крові не поверталася до базового рівня в жодній з цих двох груп (рис. 1D та E). Концентрація NEFA в сироватці крові була на 98% вищою у мишей, яких годували HFD, порівняно з тими, кого годували стандартним мишачим чау (1,14 ± 0,275 та 0,576 ± 0,031 мекв/л, P -/- мишей або мишей дикого діабету дикого типу, які отримували інгібітор 12/15-ліпоксигенази. ніж у необроблених діабетичних мишей дикого типу (50). Отже, цілком ймовірно, що надмірна експресія 12/15-ліпоксигенази, принаймні частково, пояснює посилений окисно-нітрозативний стрес та активацію PARP у нейронах периферичного нерва та DRG у мишей, що харчуються HFD.

На закінчення, HFD-миша - це тваринна модель переддіабету та ожиріння, яка розвиває функціональні, але не структурні зміни великих рухових та сенсорних нервових волокон та малих сенсорних нервових волокон PDN та демонструє свідчення підвищеної активності шляху сорбітолу, окислювальних -нітрозативний стрес, активація PARP та активація 12/15-ліпоксигенази, що розвиваються за відсутності явної гіперглікемії. Як і інші тваринні моделі захворювань людини, модель миші, що харчується HFD, може мати обмеження, які можна правильно визначити лише після досягнення консенсусу щодо проявів невропатії у людей із станами (IGT, ожиріння та метаболічний синдром), які передують і часто призводять до до розвитку явного діабету. Короткочасне втручання зі здоровою дієтою з нормальним вмістом жиру та дієтою з нормальним вмістом жиру та фідарестатом призвело до суттєвого зникнення функціональних змін, пов’язаних як із сенсорною (лише дієта), так і з сенсорною та руховою (дієта плюс ГРЗ) нейропатією. Ці висновки наголошують на обґрунтуванні розробки дієтологічних підходів для раннього лікування невропатії та інших ускладнень, пов'язаних з діабетом, у людей з ІГТ, ожирінням та метаболічним синдромом, які включають два із вищезазначених розладів.