Відсутність FFAR1/GPR40 не захищає мишей від метаболічних захворювань, спричинених дієтою

Анотація

ЦІЛЬ -FFAR1/GPR40 - це рецептор, пов'язаний з G-білком, експресується переважно в острівцях підшлункової залози, опосередковуючи секрецію інсуліну, викликану вільними жирними кислотами. Однак фізіологічна роль FFAR1 залишається суперечливою. Раніше повідомлялося, що миші-нокаути FFAR1 (Ffar1 -/-) були стійкими до гіперінуслінемії, спричиненої дієтою, гіперглікемії, гіпертригліцеридемії та стеатозу печінки. Більш недавній звіт припускає, що, хоча FFAR1 необхідний для індукованої жирною кислотою секреції інсуліну in vivo, делеція FFAR1 не захищає острівці підшлункової залози від дисфункції острівців, спричиненої жирними кислотами. Це дослідження призначене для дослідження функції FFAR1 in vivo з використанням третьої лінії самостійно генерованих мишей Ffar1 -/- на тлі C57BL/6.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ -Ми використовували CL-316,243, агоніст адренорецепторів β3, для гострого підвищення рівня вільних жирних кислот у крові та вивчення їх впливу на секрецію інсуліну in vivo. Мишей Ffar1 +/+ (дикого типу) та Ffar1 -/- (нокаут) розміщували на двох різних дієтах з високим вмістом жиру для вивчення їх реакції на ожиріння, спричинене дієтою.

РЕЗУЛЬТАТИ—Секреція інсуліну була зменшена на ~ 50% у мишей Ffar1 -/-, підтверджуючи, що FFAR1 суттєво сприяє стимуляції секреції інсуліну жирними кислотами in vivo. Однак миші Ffar1 +/+ та Ffar1 -/- мали однакову вагу, ожиріння та гіперінсулінемію на дієтах з високим вмістом жиру, а у мишей Ffar1 -/- не спостерігалося покращення тестів на толерантність до глюкози та інсуліну. Крім того, дієта з високим вмістом жиру викликала порівнянні рівні накопичення ліпідів у печінці мишей Ffar1 +/+ та Ffar1 -/-.

ВИСНОВКИ -FFAR1 необхідний для нормальної секреції інсуліну у відповідь на жирні кислоти; однак миші Ffar1 -/- не захищені від індукованої інсуліном резистентності або стеатозу печінки, спричиненого дієтою.

Жирні кислоти беруть участь у різноманітних фізіологічних функціях різних тканин. Вважається, що багато з ефектів жирних кислот опосередковані внутрішньоклітинними метаболітами довголанцюгових ефірів ацил-КоА. Проте за останні кілька років накопичилися докази того, що принаймні деякі види діяльності, що приписуються жирним кислотам, опосередковуються через їх взаємодію з низкою рецепторів, пов'язаних з G-білками, позначеними FFAR1 (GPR40), FFAR2 (GPR43), FFAR3 ( GPR41), GPR120 та GPR84. FFAR2 та FFAR3 активуються коротколанцюговими жирними кислотами, тоді як FFAR1, GPR84 та GPR120 активуються жирними кислотами середнього та довгого ланцюга (1). Серед цих рецепторів FFAR1 та GPR120 звернули увагу на їх потенціал як терапевтичних цілей для метаболічних захворювань (2–4).

Тут ми повідомляємо про метаболічні фенотипи на третій, незалежній лінії мишей Ffar1 -/-, генерованих на фоні C57BL/6Ncrl (B6). Ми виявили, що FFAR1 сприяє приблизно 50% вивільнення інсуліну, зумовленого жирними кислотами, in vivo, що відповідає попередньому звіту Latour et al. (7). На відміну від попередніх спостережень Steneberg et al. (5), однак, наші миші Ffar1 -/- не захищені від негативного впливу дієти з високим вмістом жиру. Миші Ffar1 -/- на дієті з високим вмістом жиру страждали ожирінням, розвивали резистентність до інсуліну та накопичували ліпіди в печінці у подібній мірі порівняно з однокурсниками Ffar1 +/+. У сукупності наші дані підтверджують, що FFAR1 важливий для опосередкованої жирними кислотами секреції інсуліну, але ставлять під сумнів його роль у опосередкуванні токсичного впливу вільних жирних кислот на метаболічні захворювання.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Породження мишей Ffar1 -/- на фоні C57BL/6NCrl (B6).

Мишей Ffar1 -/- генерували на замовлення DeltaGen (Пало-Альто, Каліфорнія). Коротко кажучи, вектор націлювання був розроблений для видалення 152-bp фрагмента, що відповідає позиції 143–294 відкритої рамки зчитування гена Ffar1 (NM_194057). Цей сегмент був замінений касетою з неоміцину (нео). Вектор электропорировали в 129/OlaHsd-похідних клітин ембріонових стовбурів (ES) клітин, а G418-стійкі колонії ES-клітин відібрали та розширили для аналізу ДНК. Правильно націлені клітини ES вводили в бластоцисти для отримання химерних мишей, які потім спаровувались з самками В6. Гетерозиготне потомство Ffar1 (Ffar1 +/-) було виявлено за допомогою стратегії скринінгу на основі ПЛР. ПЛР-праймери були розроблені для виявлення як алелів дикого типу (234 bp), так і нокаутів (399 bp). Послідовності олігонуклеотидів були такими: Ffar1 перед течією видаленої області вперед, 5′-cccagcttggtctacactctccatc-3 ′; Ffar1 нижче за течією віддаленої області реверс, 5′-gatggcttggtacccgaaggggaag-3 ′; та нео вперед, 5′-gggtgggattagataaatgcctgctct-3 ′. Потім мишей Ffar1 +/− схрещували для отримання мишей Ffar1 -/-. Мишей Ffar1 -/- повторно схрещували до мишей C57BL/6NCrl протягом> 10 поколінь, щоб генерувати мишей на тлі B6.

Секреція інсуліну in vivo у відповідь на гостро підвищений вміст вільних жирних кислот.

Мишам Ffar1 +/+ та Ffar1 -/-, які не їли, вік та стать відповідали, отримували інтраперитонеальну ін’єкцію фізіологічного розчину або β3-агоніста CL-316243 (Sigma-Aldrich) у дозі 1 мг/кг (8). Через 15 хвилин після ін’єкції у кожної миші відбирали ∼700 мкл крові шляхом серцевої пункції відразу після задушення СО2. Для збереження глюкагоноподібного пептиду 1 (GLP-1) інгібітор DPP-IV (Linco) додавали в попередньо охолоджені пробірки для збору крові (BD Microtainer 365974; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) та плазму, виділену центрифугуванням при 5000 об/хв протягом 10 хв при підтримці температури 4 ° С. Аликвоти зразків плазми зберігали при -80 ° C до аналізу. Рівні інсуліну та аміду GLP-1 (7-36) у плазмі крові оцінювали за допомогою наборів від Meso Scale Discovery (Гейтерсбург, MD). Рівні лептину, аміліну та глюкагону вимірювали за допомогою наборів Lincoplex Luminex (Linco Research, St. Charles, MO). Глюкозу, вільні жирні кислоти та тригліцериди вимірювали за допомогою комерційних наборів від Wako Diagnostics (Richmond, VA).

Дослідження дієтичного харчування з високим вмістом жиру.

Усі миші, яких досліджували, були відлучені від лабораторної дієти для гризунів 20 (4,5% жиру; PMI Nutrition International) і, якщо не вказано, були розміщені в клітинах з полікарбонату в конкретному середовищі, вільному від патогенів, протягом 12-годинного циклу світло/темрява при температурі 22 ° C. В одному дослідженні мишей із поколінням N6 з зворотним схрещуванням на фоні В6 годували протягом 8 тижнів діабетогенною дієтою Surwit (58% калорій від сала) або напівочищеною нежирною дієтою (D12450B; 10% калорій з жиру; Дієти досліджень, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі) ad libitum. В окремому дослідженні мишей при ≥N10 зворотного перетину на тлі В6 годували напівочищеною дієтою з 60% калорій з жиру (Research Diets). Склад тіла оцінювали за допомогою резонансної спектроскопії ядерних магнітів. Мишей вбивали задушенням CO2 для збору крові та тканин через 4 години голодування. Рівні глюкози, жирних кислот та тригліцеридів у плазмі крові вимірювали, як описано вище. Нейтральні ліпіди печінки (ефір холестерину, вільний холестерин та тригліцериди) аналізували за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, як описано раніше (9). Усі дослідження проводились в акредитованій Американській асоціації лабораторних доглядів за тваринами згідно з протоколами, затвердженими Комітетом з питань догляду за тваринами та догляду за тваринами Шерінга-Плуга.

Тест на толерантність до глюкози та інсуліну.

Кров збирали через 16 годин голодування і вимірювали базальний рівень глюкози методом глюкозооксидази (Glucometer Elite; Bayer, Elkhart, IN). Після цього виміру глюкозу (3 г/кг маси тіла) або інсулін (0,75 мО/г маси тіла) вводили внутрішньочеревно, а кров збирали з хвостової вени через 20, 40, 60, 90 та 120 хв після доза для визначення глюкози.

Аналіз даних.

Дані подаються як середні значення ± SE. Статистичний аналіз проводили за допомогою GraphPad Prism (версія 4.00; Програмне забезпечення GraphPad) з використанням неспарених t-тестів Стьюдента, одностороннього ANOVA або двостороннього ANOVA, залежно від структур даних. Конкретні використовувані методи вказані в тексті. Значення P -/- миші, сегмент гена, що кодує частину другого трансмембранного домену, весь перший позаклітинний домен, і частина третього трансмембранного домену білка FFAR1 була націлена на гомологічну рекомбінацію (рис. 1А). Цільові клітини ES спочатку скринінгували за допомогою ПЛР, а позитивні клони ідентифікували за допомогою Саузерн-блот, використовуючи зонди, які гібридизуються поза і поруч з цільовими конструкціями. Мишей Ffar1 -/- отримували з позитивного клону ES (ES 1315) (Фіг. 1B). Приклади генотипів ПЛР від окремих мишей Ffar1 +/+ (дикого типу), Ffar1 +/− (Het) та Ffar1 -/- (нокаут) мишей показані на рис. 1С. За оцінкою кількісної RT-PCR у реальному часі, у мишей Ffar1 -/- відсутні експресія мРНК Ffar1 на острівцях підшлункової залози або в селезінці (рис. 1D). Миші Ffar1 -/- народилися при очікуваному співвідношенні Менделя 1: 2: 1 і здавались здоровими та фертильними, і ніяких відхилень при грубому обстеженні не виявлено. В умовах годування чау ми не спостерігали явної різниці в метаболічних фенотипах між мишами Ffar1 +/+ та Ffar1 -/-.

Стимульована жирною кислотою секреція інсуліну послаблювалась у мишей Ffar1 -/- in vivo.

ОБГОВОРЕННЯ

Вільні жирні кислоти представляють щось на кшталт Джекіла та Гайда щодо метаболічних захворювань. Хоча збільшення вмісту жирних кислот у плазмі крові є однією з ознак харчування, що призводить до посиленої секреції інсуліну після прийому їжі, вважається, що тривале підвищення рівня вільних жирних кислот у плазмі крові, яке спостерігається при ожирінні, сприяє зменшенню секреції інсуліну і, зрештою, дисфункції острівців та розвитку діабет 2 типу. У цьому контексті розуміння функції FFAR1 як рецептора клітинної поверхні для жирних кислот стає дуже важливим. З цією метою ми створили лінію мишей Ffar1 -/- для використання як інструмент для вивчення цього рецептора.

На закінчення, це дослідження демонструє, що FFAR1 сприяє підтримці основного метаболізму і що видалення FFAR1 не захищає мишей від метаболічних захворювань, спричинених дієтою. Наші результати, поряд з результатами нещодавно опублікованих досліджень (7,12–14), спільно стверджують, що антагоністи FFAR1 можуть не дати значної вигоди для діабету 2 типу, пов’язаного з ожирінням.

Покоління мишей Ffar1 -/-. В: Схематичний вигляд регіонів, виснажених геном Ffar1. Фрагмент 152 bp, що відповідає позиції 143–294 відкритої рамки зчитування гена Ffar1 (NM_194057), був замінений на неокасету. Дві чорні смуги під нижньою панеллю представляють положення 5 'і 3' зондів, що використовуються для промокання Southern. B: Саузерн-блот, клони клітин ES. Показані зразки ДНК від двох нецільових ES-клонів та цільового клону (ES 1315), перетравлених EcoRV, зондованих 5 ′ зондом та HindIII та зондованих 3 ′ зондом відповідно. C: Репрезентативний генотипування ПЛР зразків ДНК із хвостових затискачів мишей Ffar1 +/+ (WT) та Ffar1 -/- (KO). Алель WT становить 234 bp, а алель KO розміром 399 bp. D: Експресія мРНК Ffar1 на острівцях підшлункової залози та селезінці мишей Ffar1 +/+ (WT) та Ffar1 -/- (KO), доступ до яких здійснюється за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі.

Метаболічні характеристики мишей Ffar1 +/+ та Ffar1 -/- через 8 тижнів на дієті з низьким вмістом жиру та дієти з високим вмістом жиру. Мишей Ffar1 +/+ та Ffar1 -/- при генерації N6 з зворотним схрещуванням на фоні В6 годували протягом 8 тижнів на діабетогенній дієті Surwit (58% калорій від сала) або напівчищеній нежирній дієті (10% калорій з жиру ) ad libitum. n = 5 мишей на групу. Вага тіла та жир в організмі контролювались щотижнево. Споживання їжі вимірювали щотижня. Тести на толерантність до глюкози (ГТТ) проводили до того, як мишей вбивали для зразків крові та забору тканин. В: Вага тіла мишей з дієтичним харчуванням. B: Маса тіла мишей, що харчуються жирним харчуванням. C: Накопичений прийом їжі мишами з дієтичним харчуванням. D: Накопичене споживання їжі мишами з дієтичним харчуванням. E: Жир в організмі мишей з дієтичним харчуванням. F: Жир в організмі мишей з нежирним харчуванням. G: Тест на толерантність до глюкози мишей з дієтичним харчуванням. H: Тест на толерантність до глюкози мишей, що харчуються нежирним харчуванням. Дані представлені як середні значення ± SE. * P +/+ і Ffar1 -/- миші в кожну точку часу.

Метаболічні характеристики мишей Ffar1 +/+ та Ffar1 -/- через 10 тижнів на 60% дієті з високим вмістом жиру (HFD). Мишей Ffar1 +/+ та Ffar1 -/- після 10 поколінь зворотного схрещування на тлі В6 годували протягом 10 тижнів на напівчищеній дієті з високим вмістом жиру (60% калорій з жиру). n = 11, Ffar1 +/+ чоловік; n = 9, Ffar1 -/- чоловік; n = 10, Ffar1 +/+ жінка; n = 10, Ffar1 -/- жінка. Масу тіла контролювали щотижня, а жирову клітку оцінювали кожні 4 тижні. В кінці дослідження були проведені тести на толерантність до глюкози (GTT) та тести на толерантність до інсуліну (ITT). В: Маса тіла самців мишей. В: Маса тіла самки мишей. C: Жир в організмі мишей-самців. D: Жир в організмі самки мишей. E: GTT мишей-самців. F: ITT мишей-самців. Дані представлені як середні значення ± SE.

Параметри плазми та печінки мишей Ffar1 +/+ та Ffar1 -/- після 8 тижнів на 10% дієті з низьким вмістом жиру та 58% дієти з високим вмістом жиру

Печінкові ліпіди мишей Ffar1 +/+ та Ffar1 -/- через 10 тижнів на 60% дієті з високим вмістом жиру

Подяка

Науково-дослідний інститут Schering-Plough повністю фінансується корпорацією Schering-Plough.

Ми вдячні за технічну підтримку Андрія Головка щодо експресії генів та Лінг Панга щодо аналізу інсуліну. Ми дякуємо докторам. Тімоті Ковальскі та Рут Даффі за критичні дискусії та доктори. Марвін Бейн та Майкл Граціано за адміністративну підтримку.

Виноски

Опубліковано до друку на веб-сайті http://diabetes.diabetesjournals.org 4 серпня 2008 року.

Читачі можуть використовувати цю статтю до тих пір, поки твір цитується належним чином, використання має навчальний характер і не приносить прибутку, і твір не змінюється. Детальніше див. На веб-сайті http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/.

Витрати на публікацію цієї статті були частково сплачені за рахунок оплати сторінок. Отже, ця стаття має бути позначена як "реклама" відповідно до 18 U.S.C. Розділ 1734 виключно для зазначення цього факту.

Прийнято 18 липня 2008 року.
Надійшла 1 травня 2008 року.

ЦУКРОВИЙ ДІАБЕТ