Молекулярне дослідження використання клітинних джерел під час проміжної регенерації печінки, спричиненої гепатектомією

Науково-дослідний центр акушерства, гінекології та перинатології Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації, вул. Опаріна, 4, Москва, 117997, Росія, Науково-дослідний інститут морфології людини, 3 Цурупа, Москва, 117418, Росія, Російський національний дослідницький медичний університет ім. Міністерство охорони здоров'я Російської Федерації, вул. Островітянова, 1, Москва, 117997, Росія

Науково-дослідний центр акушерства, гінекології та перинатології Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації, вул. Опаріна, 4, Москва, 117997, Росія, Науково-дослідний інститут морфології людини, вул. Цурупа, 3, Москва, 117418, Росія, Російський національний дослідницький медичний університет ім. Міністерство охорони здоров'я Російської Федерації, вул. Островітянова, 1, Москва, 117997, Росія

Афілійований науково-дослідний інститут морфології людини, вул. Цурупа, 3, Москва, 117418, Росія

Афілійований дослідницький центр медичної генетики, вул. Москворечі, 1, Москва, 115478, Росія

Афілійований науково-дослідний центр акушерства, гінекології та перинатології Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації, вул. Опаріна, 4, Москва, 117997, Росія

Андрій Ельчанінов,
Тимур Фатхудінов,
Наталія Усман,
Євгенія Кананихіна,
Ірина Арутюнян,
Андрій Макаров,
Галина Большакова,
Дмитро Гольдштейн,
Геннадій Сухих

Цифри

Анотація

Цитування: Ельчанінов А, Фатхудінов Т, Усман Н, Кананихіна Е, Арутюнян І, Макаров А та ін. (2016) Молекулярне дослідження використання клітинних джерел під час проміжної регенерації печінки, спричиненої гепатектомією, у щурів. PLoS ONE 11 (9): e0162613. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0162613

Редактор: Матіас А. Авіла, Медичний факультет Університету Наварри та Центр прикладних медичних досліджень (CIMA), ІСПАНІЯ

Отримано: 17 лютого 2016 р .; Прийнято: 11 серпня 2016 р .; Опубліковано: 15 вересня 2016 р

Наявність даних: Усі відповідні дані містяться в роботі.

Фінансування: Ця робота була підтримана Російським фондом фундаментальних досліджень (http://www.rfbr.ru/rffi/eng; Угода 14-04-01224 від 26 грудня 2013 р., ТФ) та Грантом Президента Росії для молодих вчених (https://grants.extech.ru/; № 14.120.14.6239 від 3 лютого 2014 р., AE). Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Регенерація печінки ссавців надихнула на величезну кількість досліджень. Більшість досліджень проведено на лабораторних гризунах із використанням моделі часткової гепатектомії, тобто шляхом висічення серединної та лівої часток, які складають близько 70% від обсягу органу [1]. Процедура в даний час стандартизована та доступна у продажу [2], тоді як варіації у видаленому обсязі можуть здаватися менш показовими, поки ними займається набагато менша кількість досліджень [3,4].

Проте резекції надзвичайно великого обсягу (80–90%) органу представляють особливий інтерес завдяки своїй клінічній значущості. Лікування залишків печінки невеликого розміру все ще залишається проблемою [5], і ознаки гострої печінкової недостатності часто розвиваються під час трансплантації печінкової тканини, коли трансплантат занадто малий для підтримки гомеостазу. Подібна реакція на системному рівні характерна для пацієнтів, печінка яких була піддана екстенсивній резекції, залишаючи надзвичайно малу частину органу, щоб утримати поширення пухлини [5,6].

Ряд генів з диференціальною експресією пов'язаний з певними критичними точками регенерації печінки; список включає цитокіни (Il1b, Il6, Il10), фактори росту (Hgf, Tgfb, Fgf2, Tnfa) [7,8,9] та інші регуляторні молекули. Примітно, що описи структури експресії для конкретної молекули можуть відрізнятися в деталях. Наприклад, деякі автори виявили, що експресія генів Il1b, Il6, Il10, Hgf, Tgfb та Fgf2 залишається підвищеною протягом 2-3 днів після проміжної резекції [10,11,12], тоді як інші описують це як серії коротких спалахів або у вигляді одного шипа [6].

Завдання цього дослідження включало оновлену характеристику регенерації печінки з дрібних залишків з точки зору експресії генів, а також оцінку внеску гепатоцитів та HPC.

Матеріали і методи

Експериментальна модель

Прикордонний стан, спричинений сумарною 80% гепатектомією у щурів, описується як гостра печінкова недостатність. Стан вирішується протягом 48 годин або спонтанною смертю тварини, або переходом до швидкого одужання (S1 Рис.), І жодних засобів для апріорного розрізнення між тими, хто вижив і не вижив, не повідомляється. Незважаючи на занепокоєння щодо неминучості невлаштованої спонтанної смерті певної частини оперованих тварин, але беручи до уваги усталений характер, послідовність та безперервну історію моделі, Комісія з етичного огляду при Науково-дослідному інституті морфології людини вирішила затвердити дослідження (Протокол № 5, 12 березня 2013 р.). Безпородних самців щурів Sprague-Dawley, маса тіла 300–400 г, отримано в Інституті біоорганічної хімії, відділення тваринницьких установ (м. Пущино, Московська область, Росія). Усі експериментальні роботи з тваринами проводились відповідно до стандартів лабораторної практики (Національне керівництво № 267 Міністерства охорони здоров’я Російської Федерації, 1 червня 2003 р.), І всі зусилля були зроблені для мінімізації страждань.

Хоча будь-яке експериментальне дослідження регенерації печінки звичайно відповідає давно встановленій загальній схемі, конструкція неминуче вимагає специфікацій, пов'язаних з конкретними завданнями дослідження, з основними проблемами, що представляються розумним вибором контролю (або цілим, або цілим ) та належне врахування незрозумілих факторів, які включають хірургічно спричинену реакцію на стрес та системні прояви гострої печінкової недостатності, але також правильну інтерпретацію варіацій між окремими тваринами в групах та засоби обліку таких варіацій з метою збільшення надійність статистичної обробки даних.

Тваринам оперували, як описано в інших місцях [2], під загальним наркозом діетиловим ефіром (Медхімпром, Московська область, Росія; 0,08 мл на літр об'єму камери [20]), з 9 ранку до 11 ранку. Діетиловий ефір зазвичай використовується як знеболюючий засіб для моделювання регенерації печінки за допомогою гепатектомії [4,12]. У наших умовах це забезпечило найменший негативний вплив на виживання тварин порівняно з його альтернативами, Zoletil ®100 та ізофлураном, ймовірно, через його високий рівень легеневого кліренсу (за оцінками, 90% поглиненого діетилового ефіру видихається незмінним) у поєднанні з мінімальний внесок печінкового метаболізму в швидкості його виведення.

Для доступу до печінки на шкірі та черевній стінці на рівні органу робили поздовжні надрізи на черевній та середній лініях; м'які ретрактори використовувались для збільшення хірургічної видимості. Печінку екстерналізували, а судини серединної, бічної та верхньої правої часток печінки постійно перев’язували; згодом серединну, ліву та верхню праву частки вирізали (приблизно 80% видалення органу) і закріпили як контрольні зразки для аналізу експресії генів (див. нижче). Решту часточок, тобто нижню праву і хвостату, що зберігалася вологою протягом всієї процедури стерильним фізіологічним розчином, поверталися у вихідне положення в черевній порожнині, і поле ще раз промивали стерильним фізіологічним розчином. Вентральний та спинний розрізи закривали швом та обробляли 0,05% хлоргексидином біглюконатом з подальшим вмиванням спиртом.

Оперованих тварин, по двоє в клітці, утримували для відновлення в кімнаті з регульованою температурою з циклом 12:12 год світло-темно та необмеженим доступом до їжі та води. Здоров’я тварин перевіряли 4 рази на день протягом перших 48 годин після операції, а потім 2 рази на день до жертви. Мелоксикам (1,0 мг/кг/день) неодноразово вводили в жирову прокладку шиї тваринам як післяопераційне знеболення протягом двох днів після операції; додатково, гентаміцин (3,0 мг/кг/добу) вводили підшкірно у вигляді антибіотика в перший день після операції.

Тварин брали з експерименту в CO2-камері через 3 год, 6 год, 12 год, 24 год, 30 год, 48 год, 72 год, 5 днів, 7 днів або 10 днів після операції (5–6 тварин на кожен термін); вся маса регенеруючої тканини печінки була негайно розібрана та зважена до аналізу.

Всю тканину печінки, вилучену в ході операції, ретельно збирали та зберігали для подальших досліджень. Зокрема, кількісні дані про експресію генів для тканини лівої частки, отримані шляхом резекції в день операції, безпосередньо порівнювали з відповідними даними для правої частки тієї ж тварини, зібраної через 3 години до 10 днів після операції; цей алгоритм рекомендується мінімізувати варіації, властиві порівнянню перед- та післяопераційної печінки різних тварин та збільшити потужність статистичних підходів для виявлення відмінностей у експресії генів [21]. В якості альтернативи, печінкова тканина тварин, які не оперувались або не підробляли, служила додатковим контролем при оцінці відновлення маси печінки та проліферації гепатоцитів, функціональних тестах, імунозабарвленні та аналізі вестерн-блот. Процедура фіктивної операції точно відтворила всі етапи хірургічного втручання, за винятком того, що частки печінки лише ненадовго екстерналізувались, а потім повертались у вихідне положення. Неоперована контрольна група включала інтактних самців щурів (n = 10), які відповідали всім параметрам експериментальної групи.

Функціональні тести

Відновлення функції печінки оцінювали за допомогою концентрації альбуміну в сироватці крові та тестів на аланінамінотрансферазу (ALT). Концентрацію альбуміну визначали за допомогою фотометричного тесту Albumin DiaS® з бромокрезольним зеленим (DIAKON-DS, Пущино, Росія), а активність ALT вимірювали за допомогою фотометричного тесту GPT Dias® (DIAKON-DS), згідно з протоколами виробника.

Світлова мікроскопія та кількість клітин

Тканини фіксували у 10% формалізованому нейтрально забуференному формаліні (BioVitrum, Санкт-Петербург, Росія), згодом зневоднювали, вкладали у парафін та розрізали за допомогою роторного мікротома; зрізи 5–7 мкм фарбували гематоксиліном та еозином (BioVitrum Санкт-Петербург, Росія).

Проліферацію гепатоцитів оцінювали шляхом обчислення мітотичного індексу, вираженого в тисячних частинах (‰). Мітотичні цифри підраховували вручну на 6 × 10 3 клітин для кожної тварини.

Імунозабарвлення

Первинні антитіла до Sox9 або цитокератину 19 (CK19; Abcam, Кембридж, Великобританія) застосовували у розведенні 1: 100 після попередньої обробки предметних стекол буфером цитратного натрію (10 мМ цитрат натрію, 0,05% Tween 20, pH 6,0, попередньо нагрітий до кипіння відповідно до нагрітого індукованого протоколу отримання епітопу, рекомендованого виробником). Розвиток сигналу проводився за допомогою імунопероксидазної процедури; предметні стекла були забарвлені гематоксиліном.

Клітини Sox9 + і CK19 + підраховували вручну на імунозабарвлених предметних стеклах, і відповідні показники обчислювали як частки позитивних клітин (%).

Вестерн-блот-аналіз

Вміст білків Sox9 та цитокератину 19 (CK19) у тканинах печінки визначали кількісно за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням обладнання, витратних матеріалів та протоколів Bio-Rad Laboratories, Inc. (Геркулес, Каліфорнія, США). Виділення білків з тканини печінки проводили за допомогою набору MicroSotofor ™ Cell Lysis Kit, загальний вміст білка вимірювали за допомогою Бредфорда, використовуючи Quick Start ™ бичачий γ-глобулін-стандарт, та Trans-Blot® Turbo ™ RTA Mini LF PVDF Transfer Kit був використаний для перенесення розщеплених білків з гелю на промокальну мембрану з полівініліденфторидом. Інші продукти Bio-Rad, що використовуються в цьому розділі, включали кон’югат Immun-Star Goat Anti-Rabbit (GAR) -HRP як вторинні антитіла, Clarity ™ Western ECL із системою ChemiDoc ™ для розвитку сигналу та програмне забезпечення Image Lab ™ для аналізу даних. Первинні антитіла до Sox9, CK19 або β-тубуліну (всі фірми Abcam) застосовували в розведеннях 1: 100, як рекомендував виробник.

Ланцюгова реакція полімерази (ПЛР)

Експресію молекулярних маркерів аналізували за допомогою кількісної ПЛР зворотної транскрипції в режимі реального часу. Зрізи тканини печінки, легенів або нирок, кожен приблизно 30 мм 3 об’ємом, були занурені в реагент для стабілізації РНК пізніше (QIAGEN, Hilden, Німеччина) відразу після збору, інкубували протягом ночі при 4 ° C і зберігали при - 80 ° до використання. Тканину з вирізаних часточок печінки використовували як еталон для аналізу експресії генів у регенеруючих печінках; фрагменти легенів та нирок інтактних тварин використовували в якості еталонних зразків для аналізу експресії генів у відповідних органах оперованих тварин.

Загальну РНК виділяли із зразків тканини за допомогою RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) відповідно до протоколу виробника. Розрахункова концентрація очищеної РНК в елюаті становила 0,1 г/л; якість матеріалу контролювали електрофорезом.

Для видалення слідів геномної ДНК РНК обробляли водним розчином ДНКази I, без РНКази (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA; 1 U на мкг РНК, у присутності Mg 2+, з подальшим теплова інактивація ДНКази згідно з протоколом виробника); ефективність була підтверджена за допомогою ПЛР з праймерами, специфічними для нетранскрибованих геномних областей. Зворотну транскрипцію загальної РНК до випадково грунтованої одноланцюгової кДНК проводили за допомогою MMLV RT Kit (ЗАТ «Євроген», Москва, Росія); синтез проводили при 39 ° С протягом 1 години. Після теплової інактивації ферменту реакційну суміш розбавляли 2 обсягами буфера ТЕ (10 мМ Трис рН 8,0, 0,1 мМ ЕДТА) для подальшого використання та зберігання; остаточне розведення суміші в ПЛР становило 1: 250.

Ланцюгові реакції полімерази встановлювали в двох примірниках на основі qPCRmix-HS SYBR (ЗАТ «Євроген») з олігонуклеотидними праймерами (на замовлення SYNTOL, Москва, Росія) у кінцевих концентраціях 0,2–0,4 мкМ. Структури олігонуклеотидів із позначеннями та описами відповідних мішеней наведені в таблиці 1. Ампліфікацію з виявленням та цифровим аналізом флуоресценції в реальному часі проводили на ПЦР DT-96 у реальному часі (АТ ДНК-Технологія, Москва, Росія) у стандартному режимі 95 ° C протягом 5 хв з наступним (95 ° C 15 с, 62 ° протягом 10 с + зчитування, 72 ° протягом 20 с) × 45.