Молекулярне збіг між популярною травою для схуднення Hoodia gordonii та GPR119, потенційною мішенню для метаболічних розладів

Шуйонг Чжан

Шанхайська ключова лабораторія досліджень сигналізації та захворювань, Лабораторія рецепторної біомедицини, Школа наук про життя та технології, Університет Тунцзи, Шанхай 200092, Китай;

b Ключова лабораторія досліджень рецепторів Китайської академії наук, Національний центр скринінгу наркотиків, Шанхайський інститут Materia Medica, Китайська академія наук, Шанхай 201203, Китай; і

Юйонг Ма

c Державна ключова лабораторія хімії біоорганічних та природних продуктів, Шанхайський інститут органічної хімії, Китайська академія наук, Шанхай 200032, Китай

Цзін Лі

Junjun Ma

Бяо Ю

Сінь Се

Внески автора: B.Y. та X.X. розроблені дослідження; S.Z., Y.M., J.L. та J.M. проводили дослідження; S.Z., Y.M., J.L., J.M., B.Y. та X.X. проаналізовані дані; та S.Z., Y.M., B.Y. та X.X. написав роботу.

Пов’язані дані

Значимість

Ожиріння є однією з найпоширеніших проблем здоров'я сьогодні. Харчові добавки на рослинній основі широко використовуються для лікування ожиріння. Серед них надзвичайно популярні африканські кактусоподібні добавки Hoodia gordonii. Розробка Hoodia та P57, передбачуваного активного інгредієнта, була проблематичною через суперечки щодо прав інтелектуальної власності та обмежених природних ресурсів. На сьогоднішній день справжні активні компоненти та молекулярні мішені Hoodia залишаються неясними. Тут ми демонструємо, що Гордонозид F, сполука з Hoodia, активує GPR119, рецептор, який критично бере участь у метаболічному гомеостазі, і призводить до збільшення секреції інсуліну та зменшення споживання їжі. Описаний тут успішний синтез гордонозиду F дасть можливість розробляти нові препарати для лікування метаболічних захворювань.

Анотація

Ожиріння є однією з найпоширеніших проблем, пов’язаних зі здоров’ям, яка страждає понад 300 мільйонів людей у всьому світі (1). Ожиріння асоціюється з низкою захворювань та може призвести до них, включаючи діабет 2 типу (T2D), серцево-судинні захворювання, остеоартроз, дисліпідемію та апное сну, багато з яких можна запобігти зменшенням маси тіла (1). Поточні стратегії управління вагою тіла включають обмеження калорій, регулярні фізичні вправи та модифікацію поведінки. Хоча ефективні в короткостроковій перспективі, більшість пацієнтів важко підтримувати дієту і фізичні вправи протягом довгого періоду. Таким чином, шукали ліки та альтернативні методи лікування. Комерційний ринок препаратів від ожиріння величезний, але, на жаль, доступні лише два препарати, схвалені FDA, фентермін та орлістат, обидва з обмеженою ефективністю, але значними побічними ефектами (2).

Харчові добавки на рослинній основі є одними з найбільш широко використовуваних альтернативних методів лікування ожиріння. Однак їх ефективність, безпека та механізм дій значною мірою залишаються невідомими. Серед них надзвичайно популярні добавки Hoodia gordonii. Африканська кактусовидна H. gordonii (Asclepiadaceae) - сукулентна рослина, що росте в дезереті Калахарі в Південній Африці, Намібії та Ботсвані (3). Рослина тисячоліттями використовувалась Xhomani Bushmen як пригнічувач голоду та спраги під час мисливських поїздок, а природний засіб проти ожиріння з рослини привернуло велику увагу та призвело до багатьох комерційних препаратів (4).

Рослина багата глікозидами прегнану, що містять 6-дезокси- та 2,6-дидеокси-цукри. На сьогоднішній день P57AS3 (P57) є єдиним біологічно активним компонентом H. gordonii, який, як повідомляється, має анорексигенну активність (5). Немає жодних доказів зв’язування або зміни активності відомих рецепторів або білків P57, однак повідомляється, що внутрішньоцеребровентрикулярні ін’єкції P57 щурам підвищують вміст АТФ у гіпоталамусі, що може бути сигналом ситості та пригнічувати апетитні реакції (6). Однак недавнє дослідження стверджувало, що Р57 не виявляється в мозку при пероральному введенні мишам, що робить механізми дії Р57 та H. gordonii більш невловимими (7). Розвиток та комерціалізація H. gordonii та P57 були проблематичними через суперечки щодо прав інтелектуальної власності та обмежених природних ресурсів, крім відсутності чіткого механізму, що призвело до відмови кількох великих фармацевтичних компаній від проектів Hoodia (3) . З моменту виділення P57 в літературі було розкрито більше нових глікозидів, включаючи Гордонозид A-L (8), хоча їх біоактивність залишається незрозумілою.

Тим часом було виявлено багато нових потенційних лікарських цілей, пов’язаних із порушеннями обміну речовин. Для лікування T2D та ожиріння було запропоновано сполуки, націлені на ряд рецепторів, пов'язаних з G білками (GPCR), включаючи GLP-1R, GPR40, GPR120, CB1, GCGR та β2-аденоцептор (9). Нещодавно було продемонстровано, що GPR119, GPCR, що сильно експресується в β-клітинах підшлункової залози та L-клітинах кишечника (10, 11), сприяє секреції інсуліну, стимульованої глюкозою (GSIS) (12). Ендогенні ліганди LPC та OEA сприяють GSIS, безпосередньо активуючи GPR119 на β-клітинах та побічно, активуючи GPR119 на L-клітинах, та індукують секрецію GLP-1 (13). Пероральне введення> AR231453, синтетичного агоніста GPR119, значно покращує рівень циркулюючого інсуліну, GLP-1 та GIP та знижує концентрацію глюкози в крові в тестах на толерантність до глюкози у мишей (11, 14). Доведено, що інший агоніст GPR119, PSN632408, пригнічує споживання їжі та зменшує збільшення маси тіла у щурів, на додаток до ефекту зниження рівня глюкози в крові (15). Тому GPR119 представляє привабливу мішень для терапії діабету та ожиріння.

Тут ми розкриваємо, що Гордонозид F (стероїдний глікозид, виділений з H. gordonii), але не широко відомий P57, активує GPR119 потужно і вибірково, що, отже, сприяє GSIS як in vitro, так і in vivo, і зменшує споживання їжі у тварин. Крім того, повідомляється про хімічний синтез гордонозиду F. Наведені результати не лише однозначно демонструють, що активація рецептора GPR119 є важливим механізмом, що лежить в основі терапевтичного ефекту H. gordonii, але також свідчать про те, що Гордонозид F або його споріднені органи можуть бути перероблені в нові препарати для лікування метаболічних порушень.

Матеріали і методи

Хімічні речовини та реактиви.

Гордонозид F та його природні споріднені речовини були придбані у AnalytiCon Discovery та/або синтезовані хімічним шляхом (докладніше див. Додаток SI, Матеріали та методи). Сирий екстракт H. gordonii (посилання:> EA149464) був наданий Naturex. Вектори експресії ссавців, що кодують різні GPCR і Gα16, були придбані в Ресурсному центрі кДНК UMR.

Репортерський аналіз.

Клітини, що експресують GPR119 (або інші GPCR) і CRE-luc, висівали при щільності 10000 клітин на лунку в 96-лунковому планшеті. Через 24 год культури додавали сполуки в різних концентраціях. DMSO (1%) використовували як негативний контроль. Ще через 24 години активність люциферази вимірювали за допомогою системи аналізу люциферази Steady-Glo (Promega) та багатопластинкового зчитувача EnVision (PerkinElmer) відповідно до інструкцій виробника.

Секреція інсуліну з ізольованих острівців.

Всі експерименти на тваринах були схвалені Комітетом з етики тварин Шанхайського інституту Materia Medica. Острівці були виділені, як було описано раніше (16), від знеболених самців мишей C57BL/6 або щурів Sprague – Dawley (віком 8 тижнів). Коротше кажучи, 5 мл розчину колагенази XI (Sigma, 0,25 мг/мл у HBSS) вводили в підшлункову залозу через жовчний проток і підшлункову залозу перетравлювали при 37 ° C протягом 15 хв. Відокремлені острівці збирали і культивували протягом ночі в RPMI 1640, доповненому 11,1 мМ глюкозою і 10% (об./Об.) FBS. Острівці промивали збалансованим за Hepes KRBB, що містить 0,5% безжирної BSA (буфер KRBB) і 2,8 мМ глюкози, а потім відбирали вручну під стереомікроскопом і переміщали в планшети з 24 лунками. Після попередньої інкубації протягом 30 хв при 37 ° C у буфері KRBB (2,8 мМ глюкози) острівці інкубували з різними сполуками протягом 2 годин при 37 ° C у буферах KRBB, що містять 2,8 мМ або 16,8 мМ глюкози. Збирали супернатанти, а концентрації інсуліну вимірювали за допомогою набору інсуліну Cisbio HTRF та багатопластового зчитувача EnVision відповідно до інструкцій виробника.

Експерименти in vivo.

Для перорального тесту на толерантність до глюкози (OGTT) мишам-самцям C57BL/6 голодували протягом ночі, а потім вводили або 0,5% метилцелюлози (носій), або досліджувані сполуки (n = 8 на групу лікування) у бажаних дозах через пероральний манометр. Потім вводили болюс глюкози (2 г/кг перорально). Кров відбирали у хвостового відділу у визначені моменти часу, і рівень глюкози в плазмі визначали за допомогою глюкометра. Для вимірювання інсуліну та GLP-1 сполуки та глюкозу давали голодуючим мишам, як і OGTT. Кров збирали в гепаринізовані пробірки, що містять інгібітор DPP-IV (DPP4-010; Millipore), через 10 хв після введення глюкози. Зразки плазми отримували центрифугуванням при 500 × g протягом 20 хв. Інсулін та активний GLP-1 виявляли за допомогою ІФА.

Експерименти з гострого вигодовування.

Самці мишей C57BL/6 підтримували цикл світло-темної фази з зворотною фазою і мали вільний доступ до стандартної порошкоподібної дієти для мишей. Мишей (n = 8 на обробну групу) голодували протягом ночі, а досліджувану сполуку або 0,5% метилцелюлози (носій) давали перорально. Споживання їжі контролювали шляхом зважування баночок для годування через 2 год, 4 год, 8 год та 24 год після введення препарату.

Аналіз даних.

Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism. Нелінійний регресійний аналіз проводили для формування кривих доза-реакція та значень EC50. Дані представлені як середні значення ± SEM. Були проведені двосторонні тести Стьюдента, та P Таблиця 1). Встановлено, що гордонозид F індукує експресію люциферази, керовану CRE (рис. 1А), накопичення цАМФ (рис. 1Б) та мобілізацію внутрішньоклітинного кальцію (рис. 1С) у клітинах HEK293, що експресують GPR119, із залежністю від дози EC50 0,23 мкМ, 0,76 мкМ та 6,6 мкМ відповідно. Гордонозид F продемонстрував подібну ефективність та ефективність як PSN632408 (EC50 = 0,61 мкМ, 0,69 мкМ та 4,1 мкМ у аналізах люциферази, цАМФ та кальцію відповідно), тоді як інший зареєстрований агоніст GPR119,> AR231453, показав вищу ефективність (EC50 = 0,94 нМ, 0,99 нМ та 0,53 мкМ у аналізі люциферази, цАМФ та кальцію відповідно).

Таблиця 1.

Біологічна активність природних Hoodigosides/Gordonosides (1–6) та синтетичного Gordonoside F на рецепторі GPR119 людини

NR, відсутність реакції при концентраціях до 100 мкМ.

Хімічний синтез та селективність рецепторів Гордонозиду F.

Цікаво, що серед природних Hoodigosides/Gordonosides випробуваних (1-6 у таблиці 1), лише тетрасахарид Гордонозид F (3) викликали внутрішньоклітинне накопичення цАМФ та відповідь кальцію в клітинах HEK293, що експресують GPR119; інші сполуки не виявляли активності при концентраціях до 100 мкМ. Всі ці сполуки мають один і той же аглікон, а саме Годігогенін А, який також не виявляв активності. Таким чином, глікан має важливий внесок у діяльність. Тим не менше, глікани в цих споріднених структурно значущі, відрізняючись лише кінцевими залишками ди- або трисахаридів у 4-6. Порівнюючи Гордонозид F (3) та Hoodigoside I (6), додатковий залишок глюкози (в 6) повністю скасовує діяльність. Також дивно було виявити, що P57 (1), який раніше вважався активною сполукою в рослині, взагалі не був активним.

Щоб виключити можливість того, що дуже обмежена кількість придбаних натуральних продуктів були неправильними за структурою та якістю та для подальшого вивчення діяльності in vivo, ми розпочали хімічний синтез гордонозиду F (3). Приймаючи модифікацію нашого нещодавно розробленого підходу до синтезу P57 (1) (17, 18, 19), нам вдалося синтезувати Гордонозид F (3) (докладніше див. Додаток SI, Матеріали та методи). Відрадно, що синтетичний Гордонозид F (3) активував GPR119 в аналізі цАМФ з EC50 0,44 мкМ, що узгоджується з попередніми результатами щодо природного продукту (EC50 = 0,53 мкМ, таблиця 1). Крім того, Гордонозид F (3) не викликали відповіді кальцію в клітинах HEK293, трансфікованих порожнім вектором, або 28 інших GPCR, включаючи GPR40, GPR41, GPR120, CB1, CB2, GLP-1R, β2AR та ін., при концентраціях до 100 мкМ (Додаток SI, таблиця S1 ). Ці результати вказують на те, що Гордонозид F є високоселективним агоністом GPR119. Потім ми синтезували Гордонозид F (3) у грамовій шкалі та піддав її подальшій характеристиці.