Межі в медицині

Інфекційні хвороби - спостереження, профілактика та лікування

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Паразити та рак Переглянути всі 9 статей

Редаговано
Моніка К. Ботельо

Національний інститут Сауда Доутор Рікардо Хорхе (INSA), Португалія

Переглянуто
Ракель Соарес

Університет Порту, Португалія

Сусана Г. Геррейро

Інститут досліджень та інновацій у галузі охорони здоров'я Університету Порту, Португалія

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

печінкою

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Відділ мікробіології, імунології та тропічної медицини, Науково-дослідний центр знехтуваних хвороб бідності, Школа медицини та медичних наук, Університет Джорджа Вашингтона, Вашингтон, округ Колумбія, США
  • 2 Департамент біології, Університет округу Колумбія, Вашингтон, округ Колумбія, США
  • 3 Центр нановиробництва та візуалізації, Управління віце-президента з досліджень, Університет Джорджа Вашингтона, Вашингтон, округ Колумбія, США
  • 4 Центр біорозкриття та молекулярного розвитку терапії, Австралійський інститут тропічного здоров'я та медицини, Університет Джеймса Кука, Кернс, QLD, Австралія

Вступ

Інфікування риб'ячими печінками Opisthorchis viverrini, Opisthorchis felineus, і Clonorchis sinensis залишається головною проблемою охорони здоров'я у Східній Азії та Євразії з понад 40 мільйонами випадків захворювання. O. viverrini ендемічний у регіонах Таїланду, Камбоджі, Лаосської РДР та В'єтнаму (1), а опісторхоз широко вивчався в Таїланді, де

8 мільйонів людей інфіковані, за підрахунками загальнодержавної поширеності 9,4% серед населення Таїланду в 2001 році (2, 3). Вживання в їжу недовареної риби, інфікованої стадією метацеркарії грипу, призводить до зараження людей та інших ссавців, таких як коти та собаки (1). Метацеркаріальна стадія ексцист паразитів у дванадцятипалій кишці та юнацькій кишці мігрує в жовчні протоки печінки і дозріває протягом місяця у дорослого чумака, який пасеться на жовчному епітелії. Паразити довго живуть і часто зберігаються в жовчному дереві десятки років (1, 3). Яйця метису проливаються в жовч і виходять разом з каловим потоком (1). Яйця, які потрапляють в екосистеми прісної води, можуть потрапляти в організм равликом-черевоногим Bithynia siamensis (2, 4). Паразит розвивається в межах слимака, у свою чергу вивільняючи церкарії, які шукають і проникають у шкіру риби-ципрініди, яка енцистує в рибі як метацеркарія, стадія зараження для людей та інших остаточних видів господаря (1).

Інфекція викликає гепатобіліарну хворобу, включаючи холангіт та перидуктальний фіброз (1). Що ще більш проблематично, як експериментальні, так і епідеміологічні дані сильно втягують зараження печінковою чумакою в етіологію холангіокарциноми (CCA), широко відому як рак жовчних шляхів - один з основних підтипів раку печінки (1, 5). До 81% випадків раку печінки в ендемічному регіоні Ісаан на північному сході Таїланду є CCA, який також страждає від найвищої у світі захворюваності CCA - в 65 разів перевищує рівень, що спостерігається в неендемічних регіонах (1, 5, 6). CCA - це аденокарцинома, яка, як правило, має повільний ріст і діагностується на запущеній стадії, часто з метастазуванням у віддалені місця через близькість до лімфатичних судин (4). На жаль, прогноз похмурий на запущеній стадії, коли первинна пухлина вже не піддається резекції печінки. Механізм (и), за допомогою якого інфекція ініціює генетичні ураження, які врешті-решт досягають кульмінації, є неясним, але він, ймовірно, включає запалення жовчних шляхів та системне запалення, ендогенне та дієтичне нітрозування, пов’язане із запаленням, та секрецію мітогенів та інших речовин печінковим метом.

Одним із аспектів зараження печінковим чумаком, який потенційно залучений до злоякісної трансформації, є надмірне, невпинне загоєння ран у відповідь на подальше живлення паразитами тканиною жовчних проток (2, 3, 5). Ми показали, що грануліноподібний фактор росту, Ов-GRN-1, що виділяється птахом, є домінуючим фактором проліферації і достатній для загоєння ран (2, 7). Критичним кроком у новому поколінні тканин, включаючи загоєння ран та ріст пухлини, індукований інфекцією, є стимуляція ангіогенезу - утворення нових капілярів із вже існуючих судин або судинних стовбурових клітин (8). Нова тканина вимагає ангіогенезу для постачання кисню та поживних речовин, полегшення імунного нагляду та видалення відходів виробництва (9). Складна взаємодія факторів росту та інгібіторів регулює ангіогенез, і дисбаланс може призвести до захворювання (10). Хоча ангіогенез сам по собі не ініціює злоякісне захворювання, він може сприяти прогресуванню пухлини та метастазуванню (9, 11). Ангіогенні цитокіни, включаючи фактор росту фібробластів, фактор росту судинного ендотелію (VEGF), фактор росту, одержуваний тромбоцитами, та фактор росту епідерми (9, 10) стимулюють ендотеліальні клітини або попередники до проліферації та міграції, швидко приводячи до нових капілярів та судин мереж.

Аналіз утворення канальців (TFA) забезпечує інформативний, зручний, швидкий та кількісний підхід до дослідження ангіогенезу (12). TFA включає адгезію ендотеліальних клітин, міграцію, протеоліз та утворення канальців ендотеліальними клітинами, що ініціюється після висівання клітин на гелевий базовий матрикс, природний субстрат попередників ендотеліальних клітин. Ендотеліальні клітини утворюють капілярні структури з просвітом (12). Рекомбінантний Ов-GRN-1 (рОв-GRN-1) індукує ангіогенез (ріст кровоносних судин) у зародків перепелів у аналізі хоріолантоїсної мембрани (CAM) (2). Однак ангіогенний потенціал печінкового грануліну на клітинах людини не визначений. Тут ми повідомляємо про потужну ангіогенну та мітогенну активність Ов-GRN-1 при наномолярній концентрації на первинних ендотеліальних клітинах пуповинної вени людини (HUVEC), використовуючи як високопродуктивний TFA з автоматизованим аналізом на основі ImageJ, так і з аналізом клітин в реальному часі системи xCELLigence.

Матеріали і методи

Рекомбінантне виробництво Ov-GRN-1

Очищення rОв-GRN-1 було досягнуто за допомогою системи очищення AKTA10 при 4 ° C (GE Healthcare), як описано раніше (2, 13). Коротко, BL21 Кишкова паличка бактеріальна гранула, що містить rОв-Експресійну плазміду GRN-1 лізували за допомогою трьох циклів заморожування/відтавання з подальшим обробкою ультразвуком. Отриману нерозчинну гранулу розчиняли в сечовини, що містить нікелевий буфер для зв’язку [8 М сечовини/300 мМ NaCl/50 мМ імідазолу/50 мМ фосфату натрію, рН 8 (Sigma)]. Супернатант, відфільтрований 0,22 мкМ, пропускали через 2 × 5 мл нікелевих колонок Histrap IMAC (GE Healthcare), промивали з підвищенням концентрації імідазолу та елюювали 500 мМ імідазолом у буфері для зв’язування. Переформування денатурованого сечовиною rОв-GRN-1 проводили з 28 мл смоли G10 Sephadex на колонці XK16/20 (GE Healthcare), 7 мл застосовували при 100 мкг/мл і елюювали 150-мМ NaCl, 50-мМ фосфатом натрію, рН 6. A 120 -ml колонку Superdex 30 XK16/60 (GE Healthcare) використовували для фракціонування rОв-Мономер GRN-1, елююючи в складеному розмірі, еквівалентному

1 кДа. Концентрацію білка визначали комбінацією мікропланшетного аналізу Бредфорда (Bio-Rad) відповідно до інструкцій виробника та оптичної щільності при 280 нм.

Ендотеліальні клітини пупкової вени людини

Ендотеліальні клітини пуповинної вени, об’єднані від донорів (PromoCell, Гейдельберг, Німеччина), культивували в колбах культури тканин T75 в повному середовищі EGM-2 (PromoCell) при 37 ° C у зволоженій атмосфері при 5% CO2 на повітрі. HUVEC вирощували до

80% злиття, після чого культуру трипсинізували за допомогою набору для від'єднання PromoCell (PromoCell). Клітини, досліджені за допомогою аналізу формування канальців (TFA), використовувались лише з третього, четвертого або п’ятого пасажу, з HUVEC, пасированим до

80% злиття протягом 24 годин від TFA, як описано (14).

Аналіз розповсюдження xCELLigence

Клітини висівали по 5000 клітин на лунку в 200 мкл повноцінного середовища (вище) на E-планшетах (ACEA Biosciences, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) і вирощували протягом ночі під час моніторингу за допомогою системи xCELLigence DP (ACEA Biosciences), яка контролює клітинні події в режимі реального часу шляхом вимірювання електричного імпедансу на мікродискованих золотих мікроелектродах, інтегрованих на дні пластин для культури тканин. Клітини тричі промивали PBS і замінювали 180 мкл базального середовища EGM-2 (без факторів росту або добавок) та інкубували протягом мінімум 6 годин перед подальшою обробкою. Обробки готували в концентраціях 10 × і додавали до кожної лунки загальним об'ємом 20 мкл. XCELLigence DP реєструвала показники клітинного індексу кожні 15 хв протягом 3 днів після лікування. Показання клітинного індексу нормалізували перед лікуванням, а коефіцієнти проліферації клітин визначали з чотирьох біологічних повторностей і представляли відносну кількість клітин порівняно з контрольними клітинами. Для порівняння був використаний двосторонній ANOVA з тестом множинних порівнянь Холма – Сідака Ов-Лікування GRN-1 до середнього контролю, с P ≤ 0,05 вважається значущим.

Аналіз формування канальців (TFA)

Знижений фактор росту Матригель (Corning, Corning, NY, USA) висівали на 96-лункову тарілку з μ-ангіогенезом (ibidi, Planegg, Німеччина) при 10 мкл/лунку та інкубували при 37 ° C у 5% CO2 на повітрі протягом 60 хв, як описано (14). HUVEC відокремлювали (вгорі) і ресуспендували в повному середовищі для росту клітин ендотелію 2 (EGM-2) (PromoCell) і висівали на 10000 клітин/лунку в середовище, доповнене 10 мкМ сульфорафаном (SFPH, Sigma) (негативний контроль), 1,2 нМ VEGF-165 (Novus Biologicals) (позитивний контроль) або 5, 10, 20 та 40 нМ Ов-GRN-1. Ібіді-пластину інкубували протягом 12 год у зволоженій атмосфері 5% СО2 у повітрі при температурі 37 ° С у верхньому інкубаторі мікроскопа (OKOLAB, Поццуолі, Неаполь, Італія). З інтервалом збирали мікрофотографії клітин та зароджених та розвинених канальців за допомогою автоматизованого платформного мікроскопа Leica DMi8 під яскравим полем зі збільшенням 2,5 × та програмного забезпечення Leica LASX (Leica).

Аналіз утворення канальців

Автоматизовану оцінку ангіогенезу проводили на TFA 490 2-піксельних зображеннях за допомогою ImageJ (NIH) за допомогою інструмента плагіна для фазово-контрастного аналізатора Ангіогенезу, як описано (12, 15). Використовувались такі налаштування: мінімальний розмір об’єкта 10 пікселів; Мінімальний розмір гілки 25 пікселів; Розмір артефактичного циклу 2500 пікселів; Поріг розміру ізольованого елемента на 25 пікселів; 30-піксельний поріг розміру основного сегмента; з ітераційним числом 3. Чотири вихідні метрики (кількість осередків, кількість сегментів, довжина сегмента та кількість переходів) були побудовані безпосередньо або у відсотках відносно середньої порожньої обробки (міра обробки поділена на середню міру) . Для порівняння був використаний двосторонній ANOVA з тестом множинних порівнянь Холма – Сідака Ов-Обробка GRN-1 проти середнього порожнього контролю за чотирма показниками с P ≤ 0,05 вважається значущим.

Поєднання чотирьох показників в одну рівномірно зважену змінну було здійснено шляхом обчислення Z стандартизовані показники, які базувались на значеннях популяції (16). Формула нижче формує Z оцінка і представляла відстань між необробленою оцінкою та середнім показником сукупності в одиницях SD. Значення популяції оцінювали з 39 повторень лікування.

Комбінований надійний Z оцінка (Z*) було сформовано для кожного репліката з медіани Z оцінка з чотирьох показників. Z* бали були побудовані та Ов-Лікування GRN-1 порівняно із середнім порожнім контролем з використанням одностороннього ANOVA з тестом множинних порівнянь Холма – Сідака, P ≤ 0,05 вважали статистично значущим.

Результати

Для оцінки впливу Ов-GRN-1 на HUVEC порівняно з іншими типами клітин, ми проаналізували клітинну проліферацію та міграцію HUVEC за допомогою системи xCELLigence. Лікування за допомогою Ов-GRN-1 індукує проліферацію в ряді типів клітин (2, 4, 17). Вплив HUVEC на 5–20 нм Ов-GRN-1 показав подібну відповідь (рис. 1). Оскільки ангіогенний аналіз на HUVEC оцінювали через 12 годин, для проліферації ми зосередилися на перших 24 годинах і відзначили незначне (5–11%) незначне збільшення вище значень негативних контролів від 5 до 10 нМ Ов-GRN-1 (Малюнок 1B). Двадцяти наномолярів було достатньо для індукції значного збільшення клітинного індексу на 14% через 4 год (*P Ключові слова: гранулін, паразит, ангіогенез, загоєння ран, рак печінки, ендотеліальні клітини пупкової вени людини, аналіз формування канальців

Цитата: Хауген Б, Каріншак СЕ, Манн В.Х., Попратілов А, Лукас А, Бріндлі П.Дж. та Смут М.Дж. (2018) Гранулін, секретований харчовою печінковою гриппою Opisthorchis viverrini Сприяє розвитку ангіогенезу в ендотеліальних клітинах людини. Спереду. Мед. 5:30. doi: 10.3389/fmed.2018.00030

Отримано: 21 листопада 2017 р .; Прийнято: 29 січня 2018 року;
Опубліковано: 16 лютого 2018 року

Моніка Катаріна Ботельо, Національний інститут Сауда Доутора Рікардо Хорхе (INSA), Португалія

Ракель Соарес, Університет Порту, Португалія
Сусана Гомес Геррейру, i3S, Інститут розслідування та іновацій в Сауді, Португалія

† Ці автори зробили однаковий внесок у цю роботу.