Межі в імунології

Поживна імунологія

Редаговано
Вільсон Савіно

Фонд Освальдо Крус (Fiocruz), Бразилія

Переглянуто
Зіджіян Чжан

Медичний коледж Бейлора, США

Чжунхай Янь

Колумбійський університет, США

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

ifn-γ

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Інститут медичної мікробіології, імунології та паразитології, Університетська лікарня Бонн, Бонн, Німеччина
  • 2 відділення з імунопатології, Інститут клінічної хімії та клінічної фармакології, Університетська лікарня Бонн, Бонн, Німеччина
  • 3 Німецький центр з вивчення інфекцій (DZIF), партнерський сайт Бонн-Кельн, Бонн, Німеччина

Графічний реферат. Адипонектин пом'якшує запалення Т-клітин CD4, стримуючи гліколіз. Підвищений рівень адипонектину під час нормальної дієти чау обмежує гліколіз клітин Th1 і Th17, що зменшує секрецію IFN-γ та IL-17 та призводить до поліпшення чутливості до інсуліну. У дієтичних мишей з високим вмістом жиру гіперглікемія із супутнім зниженням адипонектину збільшує гліколіз Т-клітин, що призводить до збільшення продукції IFN-γ та IL-17 та резистентності до інсуліну. Введення філаріальних екстрактів та, як передбачається, філяріальна інфекція підвищують рівень адипонектину, зменшують продукцію IFN-γ та IL-17 Т-клітинами та покращують чутливість до інсуліну.

Вступ

З урахуванням того, що у 2013 р. У всьому світі повідомили про 2 мільярди людей із надмірною вагою або ожирінням, рівень ожиріння зростає тривожною швидкістю (1). Зростає кількість доказів, що пов'язують вроджені імунні клітини загалом та макрофаги, зокрема, із запаленням та резистентністю до інсуліну (2). Під час ожиріння макрофаги інфільтрують розширювальну жирову тканину і переходять із переважного протизапального фенотипу М2 на прозапальний фенотип М1 (3, 4). Недавні звіти визначають Т-клітини як ключових гравців адаптивної імунної системи в організації запальних ефектів макрофагів і тим самим сприяють резистентності до інсуліну (5, 6).

Під час ожиріння збільшена кількість Т-клітин пам'яті відбувається в жировій тканині (7), а виснаження Т-клітин в цілому або особливо з жирової тканини зменшує запалення жирової тканини у ожирілих мишей та покращує резистентність до інсуліну (7, 8 ). На додаток до звичайних антигенпрезентаційних клітин, таких як макрофаги, дендритні клітини та В-клітини, неімунні клітини, такі як адипоцити, експресують молекули, що представляють антиген, і разом з адипоцитокінами потенційно регулюють активацію Т-клітин у жировій тканині (9, 10). Однак немає чіткого розуміння того, як модулюються імунні відповіді Т-клітин під час ожиріння і як звичайні та нетрадиційні антиген-презентуючі клітини модулюють запалення Т-клітин.

Розчинні фактори, що секретуються адипоцитами, такі як ліпіди та адипоцитокіни, включаючи лептин або адипонектин, та їхні подальші сигнальні події можуть модулювати Т-клітини (10, 11). Ще одна грань опосередкованої адипоцитокінами регуляції функції Т-клітин - це їх вплив на харчові потреби цих клітин, які, в свою чергу, жорстко контролюють їх метаболічну функцію. Функція ефекторних Т-клітин підживлюється глюкозою за рахунок аеробного гліколізу, який стає все більш доступним при резистентності до інсуліну (12). Нещодавно було показано, що лептин є вирішальним фактором для підтримки метаболічних ефектів активованих Т-клітин (13), а індукована натще гіполептинемія зменшує продукцію IFN-γ та IL-17 та експресію ключового гліколітичного ферменту в клітинах Th17 протягом експериментальний аутоімунний енцефаломієліт (14). Хоча було показано, що адипонектин регулює активність Т-клітин, модулюючи функції дендритних клітин (10), поки не ясно, чи адипонектин безпосередньо регулює активність Т-клітин.

У недалекому минулому гігієнічна гіпотеза була розширена з алергічних на метаболічні захворювання, такі як ожиріння та діабет (15), оскільки кілька досліджень на людях показали зворотний зв'язок між гельмінтозною інфекцією та діабетом (16, 17). Подібним чином, експериментальні дослідження на тваринах довели, що зараження гельмінтами або продукти, що походять від гельмінтів, покращують метаболічні розлади ожиріння (18, 19). Більшість досліджень показали, що гельмінтна інфекція або продукти, що походять від гельмінтів, перекошують імунне середовище жирової тканини в бік імунорегуляторного фенотипу з розширенням макрофагів М2, еозинофілів, регуляторних Т-клітин та вроджених лімфоцитів 2 типу (ILC2), які можуть полегшити жирову клітковину запалення тканин (15, 20). Ми повідомляли про зараження гризучою нитчатою нематодою Litomosoides sigmodontis або введення сирої сировини L. sigmodontis екстракт глистів для дорослих (LsAg) покращує толерантність до глюкози у мишей із ожирінням (19). У цьому дослідженні ми демонструємо, що лікування LsAg модулює активацію CD4 + Т-клітин під час ожиріння за допомогою механізму, опосередкованого адипонектином, і наводимо докази ролі потенційного інсуліну, сенсибілізуючого адипокін-адипонектин у регуляції функції Т-клітин, стримуючи гліколіз Th1 і Th17 під час високого вмісту жиру. дієта (HFD).

Матеріали і методи

Заява про етику

Умови утримання тварин та процедури, використані у цій роботі, виконувались відповідно до керівних принципів Європейського Союзу щодо добробуту тварин. Всі протоколи були схвалені Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Кельн, Німеччина (84-02.04.2016.A331).

Всіх мишей утримували у вентильованих клітинах з 12-годинним циклом день/ніч, їжу та воду ad libitum. Експерименти проводили на самцях мишей C57BL/6J, придбаних у лабораторії Janvier (Le Genest-St.-Isle, Франція). Мишей утримували в приміщеннях для тварин в університетській лікарні Бонн і годували або нормальною дієтою чау (NCD) (15% жиру), або HFD (інформація про калорії: 60% кілокалорій жиру; 20% вуглеводів і 20% білка; Дієти досліджень, Inc., Brogaarden, Данія). Шість тижневих мишей-самців годували HFD протягом 12-16 тижнів, а контрольні миші отримували НИЗ.

Тест на толерантність до глюкози та інсуліну

Після 6 год голодування проводили тест на толерантність до глюкози (ГТТ). Мишам внутрішньочеревно (внутрішньовенно) вводили 1 г глюкози/кг маси тіла. Рівні глюкози в крові вимірювали в крові хвостової вени через 0, 30, 60 та 120 хв після введення глюкози за допомогою глюкометра крові (AccuCheck Advantage; Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Німеччина). Тест на толерантність до інсуліну (ІТТ) проводили через 4 год після голодування. Одна одиниця інсуліну/кг маси людського інсуліну (Sanofi-Aventis, Франкфурт, Німеччина) становила i.p. вводили і рівень глюкози в крові вимірювали через 0, 30, 60 та 120 хв після введення інсуліну. Площа під кривою (AUC) була отримана шляхом обчислення площі між віссю х та заданою кривою за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (версія 5.03; Програмне забезпечення GraphPad, Сан-Дієго, Каліфорнія, США).

Фракція судин строми та виділення спленоцитів

Через дванадцять-шістнадцять тижнів після HFD у контрольної групи брали кров і годували мишей HFD, проколюючи ланцетами вену на обличчі (Goldenrod, Braintree Scientific, Braintree MA, USA). Кров безпосередньо переносили в пробірки ЕДТА. Кров центрифугували при кімнатній температурі, а плазму зберігали до -80 ° C до використання.

Згодом мишей евтаназували передозуванням інгаляції ізофлурану (Forene ®, Abbolt, Вісбаден, Німеччина). Після розтину шкіри та очеревини евтаназованих мишей епідидимальний жир вирізали і зберігали в холодному льоду DMEM (Gibco, Thermo Fischer Scientific; Дармштадт, Німеччина). Селезінку видалили хірургічним шляхом і тримали в холодному льоду середовищі RPMI-1640 (Gibco)

Фракцію стромальної судини (SVF) виділяли від мишей NCD та HFD, як описано в інших роботах (8). Коротше кажучи, епідидимальну жирову прокладку вирізали з самців мишей, подрібнювали та розщеплювали 0,2 мг/мл колагенази (Sigma-Aldrich; Тауфкірхен, Німеччина), що містить середовище DMEM, протягом 40 хв при 37 ° C при постійному струшуванні. Плавучі адипоцити видаляли, а гранулу SVF фільтрували через фільтр 40 мкм після лізису еритроцитів (Invitrogen, Thermo Fischer Scientific).

Одноклітинну суспензію із селезінки готували шляхом механічного форсування спленоцитів через клітинний фільтр 70 мкм (BD Biosciences; Гейдельберг, Німеччина) за допомогою шприцевих поршнів. Потім еритроцити лізували за допомогою буфера лізингу ACK (Thermo Fischer Scientific) (21). Клітини використовували для культури та проточної цитометрії після отримання клітин.

Культура клітин

Після перерахування кількості клітин з SVF і суспензії одноклітинних спленоцитів клітини культивували в 12-лункових планшетах для культури тканин у концентраціях 1 × 10 6/мл у присутності форболу міристат ацетату (РМА) (50 нг/мл ) та іономіцин (1 мкг/мл) протягом 6 год у середовищі RPMI-1640 (Gibco) при 37 ° C. Через 2 години до 4-х годин перед збиранням клітин додали пробку Гольджі-Стоп/Гольджі-Пробку (BD Biosciences).

CD4 + Т-клітини виділяли із спленоцитів мишей NCD або HFD із використанням мікрогранул відповідно до протоколу виробника (Miltenyi Biotec; Бергіш Гладбах, Німеччина). Коротше кажучи, одноклітинну суспензію спленоцитів інкубували з 10 мкл мікрогранул CD4 протягом 10 хв при 4 ° C, і CD4 + Т-клітини сортували за допомогою сепаратора autoMACS Pro. Негативну фракцію інкубували з мікрогранулами CD8 + і сортували Т-клітини CD8 +.

Ізольовані CD4 + Т-клітини селезінки від мишей NCD або HFD культивували з використанням адипоцитокінів та жирних кислот у концентраціях, про які повідомлялося раніше, показаних нижче. Т-клітини стимулювали анти-CD3 (5 мкг/мл) та анти-CD28 (2 мкг/мл) у присутності адипонектину (5 мкг/мл) (Peprotech; Гамбург, Німеччина) (22), лептину (250 нг/мл) (Peprotech) (13, 23), пальмітинова кислота (Sigma-Aldrich) (0,5 мМ) (24) та олеїнова кислота (100 мкМ) (Sigma-Aldrich) (25).

Адипоцити - ко-культура Т-клітин

Виділення адипоцитів проводили, як описано раніше (26). Коротко, 100 мг жирової тканини перетравлювали колагеназою, адипоцити тричі промивали свіжими середовищами. Адипоцити мишей NCD або HFD культивували очищеними CD4 + Т-клітинами селезінки або CD8 + Т-клітинами в концентраціях 0,5 × 10 6/мл (Miltenyi Biotec) від мишей NCD або HFD, як описано раніше (27), у присутності анти-CD3 та анти-CD28, а також пробку Гольджі Стоп/Гольджі (BD Biosciences) протягом 4 год. Експерименти з трансвеллом проводили шляхом розміщення адипоцитів NCD або HFD у верхній камері та CD4 + Т-клітин у нижній камері. Контрольні лунки мали лише Т-клітини без адипоцитів. Т-клітини обробляли анти-CD3 та анти-CD28 та Golgi Stop/Golgi Plug.

Макрофаги та виснаження В-клітин

Протягом першого тижня HFD макрофаги та В-клітини виснажувались, як описано в інших місцях (28, 29). Макрофаги вичерпалися i.p. ін'єкція 150 мкл клодронатних ліпосом (Clodronate Liposomes Foundation; Нідерланди; http://clodronate.liposomes.com) і контрольні миші отримували рівні обсяги ліпосом PBS. Через три дні після первинної ін’єкції було введено другу дозу, а ізоляцію SVF виконано через 16 тижнів після початку HFD. Виснаження В-клітин проводили з використанням анти-мишачого антитіла mCD20 (Біоген; клон 18B12, ізотип IgG2a). Вводили 250 мкг антитіла з наступною ін'єкцією через 4 дні під час ранньої фази HFD.

Вестерн-клякса

CD4 + Т-клітини мишей NCD та HFD культивували анти-CD3 та анти-CD28 протягом 15 хв, і клітини лізували в буфері RIPA (Thermo Fisher Scientific) для екстракції білка. Поділ білка проводили за допомогою SDS-PAGE і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Мембрану інкубували з первинними антитілами до pAMPK або β-актину (Cell Signaling Technology; Франкфурт, Німеччина) протягом ночі. Потім мембрану інкубували з кон’югованим HRP вторинним антитілом (Технологія клітинної сигналізації) протягом 1 години. Для виявлення, візуалізації мембран і кількісної оцінки використовували підкладку для піклування Pierce ™ ECL Western (Thermo Fisher Scientific), систему зображення VersaDoc 5000 (Bio-Rad; Геркулес, Каліфорнія, США) та програму Image J.

Очищення Т-клітин

Через 12-16 тижнів після HFD або NCD селезінкові CD4 + Т-клітини виділяли шляхом магнітного поділу клітин (MACS) за допомогою набору Miltenyi. Очищені CD4 + Т-клітини інкубували з Fc-блоком (Thermo Fisher Scientific) з наступним фарбуванням CD4-PE-Cy7, CXCR3-FITC, CCR4-PE та CCR6-APC протягом 30 хв у темряві. Всі антитіла були отримані від Biolegend (Fell, Німеччина). Мертві клітини виключали фарбуванням DAPI (BD Biosciences), а клітини Th1 (CD4 + CXCR3 + CCR6–) та Th17 клітини (CD4 + CCR4 + CCR6 + CXCR3–) очищали за допомогою високошвидкісного сортувача клітин BD FACS Aria III (BD Біологічні науки).

ПЛР у режимі реального часу

Відсортовані клітини Th1 та Th17 від мишей NCD та HFD зберігали у 350 мкл RLT-буфера (Qiagen; Hilden, Німеччина) при -80 ° C. Загальну РНК екстрагували з очищених клітин Th1 і Th17 за допомогою міні-набору RNeasy (Qiagen). Загальна РНК транскрибувалася за допомогою Omniscript RT Kit (Qiagen) відповідно до інструкцій виробника з праймерами oligo-d (T) (Roche; Penzberg, Німеччина). ПЛР у режимі реального часу проводили за допомогою Thermo Fisher QuantStudio 5, використовуючи універсальну суміш ПЦР TaqMan (Thermo Fischer Scientific). Зонди TaqMan для гексокінази 1 (hk1), піруваткіназа (pkm), лактатдегідрогеназа (ldh), транспортер глюкози-1 (перенасичення-1), рецептор адипонектину-1 (адіпор1) були проаналізовані і гіпоксантин-гуанінфосфорибозилтрансфераза (hprt) використовувався як ендогенний контроль (Thermo Fisher Scientific). Для розрахунку результатів qPCR використовували метод відносного КТ (пороговий цикл на експоненціальній фазі посилення). Дельта КТ розраховували як КТ (ген, що представляє інтерес) —CT (hprt). Зміна згину була розрахована як 2 ΔКТ як описано раніше (30).

Диференціація клітин Th1 та Th17

Наїнні селезінкові CD4 + Т-клітини (CD4 + CD62L + CD44–) від мишей HFD були виділені відповідно до інструкцій виробника (Miltenyi Biotec). Диференціацію наївних CD4 + Т-клітин на клітини Th1 та Th17 проводили, як описано раніше з деякими модифікаціями (31, 32). Коротше кажучи, 48 планшетів для культури лунок покривали анти-CD3 (1 мкг/мл) та анти-CD28 (5 мкг/мл) у PBS та інкубували протягом 3 год при 37 ° С. Очищені наївні CD4 + Т-клітини (0,5 × 10 6 клітин/лунка в 0,5 мл RPMI) диференціювали на клітини Th1 у присутності IL-12 (Peprotech) та анти-мишачого IL-4 (Peprotech) у концентраціях 3 і 10 мкг/мл, відповідно, протягом 96 год у RPMI, що містить 10% FCS (Gibco). Для диференціації клітин Th17, наївні Т-клітини інкубували з IL-6 (Peprotech) та TGFβ1 (Peprotech) при 20 нг/мл та 1 нг/мл у повному середовищі RPMI протягом 96 годин.

Аналіз морського коника

Для аналізу швидкості позаклітинної закисленості (ECAR; у mpH/хв) використовували метаболічний аналізатор позаклітинного потоку Seahorse XF e 96 (Seahorse Bioscience; North Billerica, MA, USA). Диференційовані клітини Th1 і Th17 культивували в середовищі XF (Agilent; Ратінген, Німеччина), додавали 10% FCS і 10 мМ глюкози (Thermo Fischer Scientific) та аналізували за допомогою аналізатора позаклітинного потоку XF-96. Принаймні три послідовних вимірювання були записані після стимуляції анти-CD3/анти-CD28 з подальшим додаванням 5 мкг/мл адипонектину і 10 мкМ сполуки С (Merck Millipore, Дармштадт, Німеччина) (22) для гальмування сигналізації AMPK.

Лікування LsAg

LsAg готували, як описано раніше (33). Коротко, L. sigmodontis дорослих хробаків збирали з інфікованих грудних порожнин піщанок та механічно гомогенізували на льоду в PBS без ендотоксинів (PAA; Пашинг, Австрія). Супернатант збирали, а кількісну оцінку білка проводили за методом Бредфорда (Cytoskeleton; Denver, CO, USA). Аликвоти LsAg зберігали для подальшого використання при -80 ° C.

Лікування LsAg проводили, як описано раніше (19). Щодня i.p. ін'єкції 2 мкг LsAg на мишу протягом 2 тижнів робили мишам, що страждають ожирінням, протягом 14-16 тижнів HFD. Відповідні контрольні миші отримували ін'єкції PBS. Після остаточної ін’єкції LsAg були проведені GTT та імунологічні дослідження.

Умовна медіа-культура

CD4 + Т-клітини селезінки мишей із ожирінням культивували в кондиціонованих адипоцитами середовищах мишей, оброблених PBS або LsAg, PMA та іономіцином, як описано вище. Для експериментів нейтралізації адипонектину носові кондиціоновані середовища адипоцитів обробляли протягом ночі 10 мкг/мл нейтралізуючого адипонектин антитіла (анти-адипонектин, AF1119, анти-mAcrp30; R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США) або антикозовий IgG (анти-козел) 10 мкг/мл; Системи НДДКР (34). Цей нейтралізований носій використовували для культивування CD4 + Т-клітин від мишей HFD у присутності РМА/іономцицину.

Імуноферментний аналіз та розрахунки HOMA-IR

Інсулін у плазмі натще вимірювали відповідно до протоколу виробника (Crystal Chem; IL, США). Модельна оцінка гомеостазу щодо інсулінорезистентності (HOMA-IR) була отримана шляхом множення глюкози натще [ммоль/л] на рівень інсуліну натще [мкО/мл] з подальшим поділом на 22,5 (35).

Ідентифікатор адипонектину

Адипоцити виділяли з однакової маси жирової тканини у мишей, оброблених PBS та LsAg. Ізольовані адипоцити культивували протягом ночі, а кондиціоновані адипоцитами середовища (ACM) збирали та зберігали при -80 ° C до використання. Рівні адипонектину вимірювали в плазмі та ACM методом ІФА згідно з інструкціями виробника (система НДДКР; Вісбаден-Норденштадт, Німеччина).

Проточна цитометрія

Статистика

Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism версії 5.03 (GraphPad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Різниці між двома неспареними групами перевіряли на статистичну значущість за допомогою Манна – Вітні-U-тест. P-значення ** стор * стор Ключові слова: адипонектин, ожиріння, Т-клітини, запалення, філяріаз, гельмінти, гліколіз, жирова тканина

Цитування: Surendar J, Frohberger SJ, Karunakaran I, Schmitt V, Stamminger W, Neumann AL, Wilhelm C, Hoerauf A and Hübner MP (2019). Гліколіз. Спереду. Імунол. 10: 2555. doi: 10.3389/fimmu.2019.02555

Отримано: 14 червня 2019 р .; Прийнято: 15 жовтня 2019 р .;
Опубліковано: 29 жовтня 2019 р.

Вільсон Савіно, Фонд Освальдо Крус (Фіокруз), Бразилія

Чжонхай Ян, Колумбійський університет, США
Зіджіян Чжан, Медичний коледж Бейлора, США