Межі у фізіології

Клінічна та поступальна фізіологія

Редаговано
Габріеле Г. Схіаттарела

Університет Неаполя Федеріко II, Італія

Переглянуто
Маркус Ніссен

Університет Цюріха, Швейцарія

Хай-Бін Руан

Медична школа, Університет Міннесоти, США

Теодор Ф. Тоуз

Університет штату Гранд-Веллі, США

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

кордони

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • Ключова лабораторія ендокринології Національної комісії з питань охорони здоров'я та планування сім'ї, Департамент ендокринології, лікарня Пекінського союзу медичного коледжу, Китайська академія медичних наук та Пекінський медичний коледж, Пекін, Китай

Вступ

1,4 мільярда людей у ​​всьому світі досягає масштабів епідемії (O'Neill and O'Driscoll, 2015). З огляду на зростаючу поширеність ожиріння та пов'язаних із цим небезпечних для життя супутніх захворювань, включаючи діабет 2 типу, метаболічний синдром та серцево-судинні захворювання, існує нагальна потреба вивчити патогенез ожиріння та розробити ефективні стратегії лікування та профілактики (Harms and Seale, 2013) . Тому біла жирова тканина (WAT), найбільший орган накопичення енергії людського тіла, привернула велику увагу дослідників у всьому світі.

Повідомлялося, що ZAG здійснював свій ефект частково, пригнічуючи ліпогенез, а також стимулюючи ліполіз та утилізацію ліпідів (Sanders and Tisdale, 2004; Gong et al., 2009; Russell and Tisdale, 2011). Ефекти ZAG опосередковувались взаємодією з β3-адренергічним рецептором (β3-AR) і можуть бути послаблені специфічним антагоністом β3-AR SR59230 (Russell et al., 2004). Цікаво, що нещодавно був виявлений третій тип адипоцитів у ВАТ, який називається «бежевими» або «бритовими» клітинами, і дослідження продемонстрували, що ці клітини можуть активуватися при фармакологічній активації β3-AR і що вони сильно експресують роз’єднуючий білок 1 UCP1), а потім розсіює енергію (Fisher et al., 2012; Harms and Seale, 2013; Poher et al., 2015). У цьому контексті активізація побуріння ВАТ може бути перспективною терапією ожиріння та пов’язаних із цим метаболічних захворювань (Harms and Seale, 2013; Kajimura et al., 2015). Попередні дослідження в природних умовах (Рассел і Тісдейл, 2012а) та в пробірці (Sanders and Tisdale, 2004) продемонстрували, що ZAG може збільшити експресію UCP1 у коричневій жировій тканині (BAT). Однак досі незрозуміло, чи має ZAG який-небудь вплив на побуріння ВАТ.

Тому в цьому дослідженні ми мали на меті визначити рівні ZAG у сироватці крові та ZAG рівні мРНК у підшкірній ВАТ (sWAT) та дослідити її зв’язок із параметрами, пов’язаними з ожирінням, у худих та надмірних ваг/ожиріння. Крім того, ми досліджували наслідки надмірної експресії ZAG на масу тіла, жировий вміст та метаболізм глюкози у мишей із ожирінням, індукованими HFD, а також його можливі регуляторні мішені в жировій тканині, печінці та скелетних м’язах.

Матеріали і методи

Людське дослідження

Загалом 40 пацієнтів із зайвою вагою/ожирінням (ІМТ ≥ 24, вік 42,8 ± 4,5 року) та 40 худорлявих суб’єктів контролю (ІМТ -2). Усі набрані особи отримували фізичні та клінічні обстеження, а зразки крові відбирали після нічного голодування для біохімічних вимірювань. Інсулін натще вимірювали за допомогою системи Siemens Centaur XP (Siemens, Таррітаун, США), а оцінку оцінки моделі гомеостазу щодо інсулінорезистентності (HOMA-IR) обчислювали як інсулін натще (mU L -1) × глюкозу натще (ммоль L - 1) /22,5 (Уоллес та ін., 2004). Концентрації ZAG у сироватці крові визначали за допомогою комерційно доступних наборів імуноферментних аналізів ZAG (ELISA) (Biovendor Laboratorni Medicina, Модіче, Чеська Республіка) відповідно до інструкцій виробника. Коефіцієнти варіації між аналізами та між аналізами становили 3,9 та 6,6% відповідно.

Тканину sWAT людини відбирали у 40 пацієнтів із ожирінням ожиріння (ІМТ ≥ 40) або пацієнтів із ожирінням (формула 35 ≦ ІМТ ΔΔCt) (Livak and Schmittgen, 2001).

Тварини та лікування

Восьмитижневі самці мишей ICR (вагою 27–30 г., n = 31, придбані у HFK Bioscience Co. LTD, Пекін, Китай) були розміщені в Інституті лабораторних наук про тварин, CAMS та PUMC, при температурі навколишнього середовища 22 ± 1 ° C у циклі 12/12 год світло/темнота і годували ad libitum. Через 1 тиждень акліматизації мишей зважували, а потім випадковим чином розподіляли на стандартну групу їжі (SF) (n = 10), які отримували SF (білок 22%, жир 11% і вуглеводи 67%) та групу HFD (n = 21), який отримував HFD (білок 42%, жир 41%, а вуглеводи 17%). Всі експериментальні протоколи на тваринах проводились відповідно до стандартів Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин та затверджені комісією з етики лікарні Пекінського союзу медичного коледжу.

Через 8 тижнів мишей, яких годували HFD, зважували і випадковим чином розподіляли на прості групи HFD (n = 13, контрольна плазміда HFD + pcDNA3.1 (+)) та група надмірної експресії ZAG (n = 8, експресія плазміди HFD + ZAG). Мишам групи SF також внутрішньочеревно вводили рівний об'єм контрольної плазміди pcDNA3.1 (+) (n = 10, SF + pcDNA3.1 (+) контрольна плазміда). Плазмідну трансфекцію мишей проводили, як описано в нашому попередньому дослідженні (Gong et al., 2009). Коротше кажучи, плазміду експресії ZAG (по 5 мкг кожна) або плазміду негативного контролю pcDNA3.1 (+) (по 5 мкг кожна) у 150 мкл середовища OPTI-MEM (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) ретельно змішували з ліпофектаміном 2000 ( 10 мкл, Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) в 150 мкл середовища OPTI-MEM, а загальна кількість 300 мкл суміші інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хв, а потім внутрішньочеревно вводили мишам. Цю ін'єкцію проводили з частотою чотири рази на тиждень протягом 8 тижнів. Вагу тіла всіх мишей регулярно реєстрували раз на тиждень.

Внутрішньочеревинний тест на толерантність до інсуліну (IPITT) та внутрішньочеревний тест на толерантність до глюкози (IPGTT)

Наприкінці втручання були проведені IPITT та IPGTT. Для ІПІТТ миші голодували протягом 5 год, а потім інтраперитонеально вводили інсулін (Humulin R, Lilly, США, 0,75 ОД/кг); глюкозу в крові вимірювали в хвостовій вені через 0, 30, 60, 90 та 120 хв за допомогою глюкометра (Roche, Базель, Швейцарія). Щодо IPGTT, мишей голодували протягом ночі, потім внутрішньочеревно вводили 50% глюкози в дозі 2 г/кг і вимірювали рівень глюкози в крові, як у IPITT. Крім того, площа під кривою (AUC) концентрації глюкози від 0 до 120 хв була розрахована як для IPITT, так і для IPGTT.

Збір зразків тканин та вимірювання біохімічних параметрів

Після 8 тижнів втручання ZAG, WAT (включаючи пахову (iWAT), мезентеріальну (mVAT), периненальну (pVAT) та епідидимальну (eVAT) білу жирову тканину) та BAT (міжлопаткову коричневу жирову тканину) вирізали та зважили. Також були зібрані зразки тканин з печінки та скелетних м’язів правої задньої кінцівки. Загальний рівень холестерину в сироватці крові (ТК), тригліцеридів (ТГ), вільних жирних кислот, холестерину ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ-С), холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ-ЛПВЩ) та рівня глюкози в крові натще визначаються рутинними автоматизованими лабораторними методами, а інсулін натще натще визначали за допомогою комерційно доступного набору інсуліну для мишей ELISA (Linco Research Inc., MO, США). Коефіцієнт варіації інсуліну в межах аналізу становив 5,9%.

Морфологічне та імуногістохімічне фарбування жирової тканини у мишей

Фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) та імуногістохімічне фарбування UCP1 проводили в iWAT миші згідно із стандартними процедурами. У цьому процесі використовували первинне кроляче поліклональне антитіло проти UCP1 (розведення 1: 200, Abcam, Кембридж, Великобританія) та вторинне антитіло IgG проти коров’ячого IgG (розведення 1: 2000, ZSGB-BIO, Пекін, Китай). Всі зрізи для фарбування UCP1 були забарвлені гематоксиліном Гарріса (Histolab, Гетеборг, Швеція) і спостерігалися за допомогою світлової мікроскопії.

Кількісний аналіз РНК-виділення та зворотної транскрипції ПЛР (RT-qPCR) тканин миші

Повна екстракція РНК із мишей WAT, печінки та скелетної м’язової тканини та подальша зворотна транскрипція проводились, як описано вище для жирової тканини людини. Послідовності праймерів для генів-мішеней та генів внутрішнього контролю були перелічені в Додатковій таблиці 2. Рівні експресії генів-мішеней у ВАТ та скелетних м'язах нормалізувались до рівня пептидилпроліл-ізомерази А (PPIA), а рівні експресії в печінці до β-актину. Результати були виражені як кратні зміни значення Ct відносно контролю за формулою 2 -ΔΔCt (Livak and Schmittgen, 2001).

Вестерн-блот-аналіз

Загальні білки екстрагували з мишей iWAT та pVAT за допомогою набору для загальної екстракції білка (Апліген, Пекін, Китай), а концентрації білків вимірювали за допомогою набору реагентів для аналізу білка ВСА (Аплген, Пекін, Китай). Приблизно 30 мкг білка відокремлювали на 10% гелях SDS-PAGE і переносили на нітроцелюлозні мембрани (Millipore, Billerica, MA, США) шляхом мокрого перенесення (BIO-RAD, Каліфорнія, США). Мембрани інкубували з первинними антитілами (анти-UCP1, Proteintech, Ухань, Китай; анти-PGC1α, Proteintech, Ухань, Китай; анти-ZAG, Санта-Крус, Даллас, США; анти-β-актин, CST, Данверс, МА, США; анти-GAPDH, CST, Данверс, МА, США) при розведенні від 1: 100 до 1: 1000 при 4 ° С протягом ночі з подальшою інкубацією з козячим анти-мишачим/кролячим вторинним антитілом при 1: 5000 розведення протягом 1 год (ZSGB-BIO, Пекін, Китай). Конкретні білкові смуги візуалізувались за допомогою посиленої хемілюмінесценції (Апплиген, Пекін, Китай). Кількісні смуги кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення Quantity One (версія 4.6.9, BIO-RAD, Каліфорнія, США). Рівні експресії цільових білків у iWAT були нормалізовані до рівня β-актину, а рівні експресії в pVAT - до рівня GAPDH.

Статистичний аналіз

Усі дані відображаються як середнє значення ± s.e.m. за винятком випадків, коли зазначено інше. Нормальний розподіл даних перевірявся за допомогою критерію Шапіро – Вілька. Ненормально розподілені параметри були логарифмічно перетворені в нормальний розподіл. Одностороння ANOVA і Т3 Даннета пост-хок тест використовували для аналізу відмінностей між групами. Коефіцієнти Пірсона та часткової кореляції використовувались для визначення лінійної асоціації між ZAG та іншими параметрами. Всі статистичні обчислення проводились у SPSS 20.0 для Windows (SPSS Inc, Чикаго, Іллінойс, США), P # P # P # P # P Ключові слова: цинк-α2-глікопротеїн (ZAG), ожиріння, метаболізм глюкози, біла жирова тканина, активований проліфератором пероксисоми рецептор гамма-коактиватор 1 альфа (PGC1a)

Цитування: Liu M, Zhu H, Dai Y, Pan H, Li N, Wang L, Yang H, Yan K and Gong F (2018) Цинк-α2-глікопротеїн асоціюється з ожирінням у китайців та мишей із ожирінням, індукованими HFD. Спереду. Фізіол. 9:62. doi: 10.3389/fphys.2018.00062

Отримано: 16 серпня 2017 р .; Прийнято: 18 січня 2018 року;
Опубліковано: 07 лютого 2018 року.

Габріеле Джакомо Шиаттарелла, Неаполітанський університет Федеріко II, Італія

Маркус Ніссен, Цюріхський університет, Швейцарія
Хай-Бін Руан, Університет Міннесоти, США
Теодор Френсіс Тоуз, Державний університет Гранд-Веллі, США