Метод вібродисоціації для виділення певних сегментів нефрону з нирок людини та гризунів

Кафедра фізіології Медичного коледжу штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Відділ клітинної мембранології Інституту фізіології імені Богомольця, Київ, Україна

Кафедра фізіології Медичного коледжу штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Відділ клітинної мембранології Інституту фізіології імені Богомольця, Київ, Україна

Кафедра фізіології Медичного коледжу штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Відділ клітинної мембранології Інституту фізіології імені Богомольця, Київ, Україна

Кафедра фізіології Медичного коледжу штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Серцево-судинний центр, Медичний коледж штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Кафедра фізіології Медичного коледжу штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Кафедра фізіології медичного факультету Університету Айн Шамс, Каїр, Єгипет

Кафедра фізіології Медичного коледжу штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Серцево-судинний центр, Медичний коледж штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Медичний факультет Медичного коледжу штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Кафедра фізіології Медичного коледжу штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Серцево-судинний центр, Медичний коледж штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Кафедра фізіології Медичного коледжу штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Серцево-судинний центр, Медичний коледж штату Вісконсін, Мілуокі, штат Вісконсин

Клімент Дж. Заблоцький, медичний центр у справах ветеранів, Мілуокі, штат Вісконсин

Адреса для запитів на передрук та іншої кореспонденції: А. Старущенко, кафедра фізіології, Медичний коледж штату Вісконсін, 8701 Watertown Plank Rd., Мілуокі, штат Вісконсин 53226 (електронна адреса: [електронна пошта захищена]).

Анотація

Наше розуміння фізіології іонних каналів нирок майже виключно походить від досліджень, проведених на гризунах або гетерологічних системах експресії. Через обмеження доступності тканин людини молекулярні та клітинні властивості іонних каналів, що виражаються в рідній людській нирці, в основному невідомі. Крім того, не встановлено, наскільки дані, отримані на експериментальних моделях, застосовні до людини. Одним з основних факторів, що сприяють прямому порівнянню активності мембранних каналів у різних видів, є відсутність універсального та надійного протоколу виділення компонентів нефрону для подальшого аналізу ex vivo.

Наш метод був адаптований до методики вібродіссоціації, яка була вперше запроваджена Воробєвим у галузі нейронауки (22), а сьогодні стала золотим стандартом для виділення нейронів та гліальних клітин (9–11). Тут ми показуємо, що застосування цього методу для виділення ниркових канальців та клубочків має численні переваги перед існуючими методами, такими як його простота, відтворюваність та придатність для виділення добре збережених сегментів нефрону від різних видів. Крім того, у цьому дослідженні ми оцінили придатність різних модифікацій цього методу для вивчення характеристик мембранних каналів у ниркових канальцях та клубочках гризунів та дослідили електрофізіологічні властивості основних мембранних каналів K + та Na +, виражених у кортикальному наборі корітиту людини повітроводи (ПЗС).

Виділення ниркових канальців.

Всі експериментальні процедури виконувались відповідно до рекомендацій, встановлених Національним інститутом охорони здоров’я Посібник з догляду та використання лабораторних тварин і були затверджені Інституційною лабораторією Комітету з догляду та використання тварин Медичного коледжу Вісконсіна. Нирки людини були отримані від компанії, що займається заготівлею органів, де їх збирали з метою їх використання для трансплантації, але не використовували та призначили для викидання. Нирки незмінно перфузували консервованим розчином і зберігали на льоду.

Принципова схема процедури ізоляції вібродисоціації показана на рис. 1A. Для експериментів із використанням ниркової тканини людини невелику частину ділянки кори нирки розсікали і ретельно промивали в консервовальному розчині штату Вісконсін кисневим інкубаційним розчином наступного складу (у мМ): 119 NaCl, 4,5 KCl, 2 CaCl2, 1,3 MgCl2, 26 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4 та 5 глюкози (pH 7,35). Для експериментів на гризунах мишам C57BL/6 та чутливим до солі щурам Даля різного віку знеболювали ізофлураном і збирали обидві нирки. Нирки людини та гризунів розрізали на зрізи товщиною від 0,5 до 1,0 мм або вручну, або за допомогою вібраційного мікротома. Після цього зрізи можна було негайно використовувати для наступних етапів процедури ізоляції або зберігати в інкубаційній камері з нейлоновим сітчастим дном у насиченому вуглецем інкубаційному розчині при кімнатній температурі протягом 6 годин.

Рис. 1.Метод вібродисоціації для виділення сегментів нефрона. A: основна стратегія та основні етапи методу, включаючи підготовку зрізів нирок (a), інкубація зрізів в оксигенуючому розчині (b), ферментативна попередня обробка зрізів нирок (за бажанням), перенесення зрізу нирки в чашку Петрі та затискання її на дні посуду (c), а також механічна ізоляція сегментів нефрона закругленим кінчиком мікропіпетки, приєднаною до генератора частоти (d). Форма наконечника та діаметр, використані для нашого дослідження, показані в вставка мікрофотографія. Зверніть увагу, що зовнішній діаметр мікропіпетки становив 1,5 мм. e: Репрезентативне яскраве поле ниркових канальців, виділених від дорослої миші за допомогою техніки вібродисоціації. B: репрезентативні зображення фрагмента нефрону миші зі складною морфологією, виділеної за допомогою вібродисоціації. B, зліва: імуномаркірування основних клітин збірних проток аквапорином 2 (AQP2; червоний; зверху), дистальний звивистий канальчик з Na + -Cl - котранспортером (NCC; зелений; середній), а також сполучні канальці (відсутні AQP2 або NCC) і ядра (синій; знизу). B, правильно: злитий імуно маркування (зверху) та відповідне зображення яскравого поля (знизу).

Імуногістохімія.

Свіжоізольовані ниркові канальці переносили на мікроскопічні предметні стекла, покриті полілілізином, і залишали прилипати протягом 5 хв. Канальці фіксували 4% параформальдегідом, просочували, зондували первинними антитілами (1: 100, Na + -Cl - котранспортер та аквапорин 2) та відповідними міченими флуорофором вторинними антитілами (1: 500, ThermoFisher, Пітсбург, Пенсільванія) раніше описаний (14). Зображення були зроблені на конфокальному інвертованому мікроскопі Nikon A1R за допомогою об'єктива Plan Apo × 40 DIC (числова діафрагма: 0,95), керованого програмним забезпеченням Nikon Elements AR (Nikon, Токіо, Японія), та оброблені за допомогою програмного забезпечення ImageJ.

Кількісний RT-PCR аналіз.

Канальці кори нирок виділяли вібродисоціацією від 4-тижневих щурів. Сегменти нефрону ідентифікували під бінокулярним мікроскопом та розділяли вручну. Проксимальні канальці можна розрізнити за межами просвітньої кисті та відносно великими структурами. Товсті відділи трубочок висхідної кінцівки є більш прозорими і мають чіткий перехід від тонкого до більш товстого діаметру. ПЗЗ можна легко розрізнити за їх бульбашкоподібною поверхнею та трубчастим розгалуженням. Кількісний RT-PCR аналіз чистоти фракцій канальців щурів проводили за допомогою специфічних маркерів. Експресія виділених генів була кількісно визначена за допомогою кількісної RT-PCR, як описано раніше (7). Значення кінцевого порогового циклу (Ct) визначали за допомогою програмного забезпечення, впровадженого QuantStudio 6 Flex, і нормалізували до гена домашнього господарства β-актину.

Електрофізіологічні експерименти.

Для проведення електрофізіологічних експериментів зрізи нирок попередньо обробляли ферментами перед процедурою вібродіссоціації, як описано вище. Записи патч-затиску виконувались у конфігурації затискача напруги, прикріпленої до комірки, за допомогою підсилювача Axopatch 200B та аналого-цифрового перетворювача Digidata 1440A (Molecular Devices). Всі електрофізіологічні записи проводили з використанням PSS як позаклітинного розчину. Активність K + та Cl-каналу реєстрували з базолатеральної плазматичної мембрани ПЗС за допомогою патч-піпеток, наповнених розчином наступного складу (в мМ): 150 KCl, 2 MgCl2 та 10 HEPES (pH 7,35). Активність епітеліального Na + -каналу (ENaC) реєстрували на апікальній плазматичній мембрані розщеплених канальців CCD (17) за допомогою патч-піпеток, наповнених розчином наступного складу (в мМ): 140 LiCl, 2 MgCl2 і 10 HEPES ( рН 7,35). Опір патч-піпеток становив від 8 до 10 МОм.

Зображення Ca 2+.

Вібродисоціація дозволяє звільнити велику кількість декапсульованих клубочків без ферментативної попередньої обробки зрізів нирок. Клубочки легко визначали під бінокулярним прицілом та збирали вручну в конічній пластиковій пробірці (500 мкл), що містить PSS. Для виявлення змін у внутрішньоклітинній концентрації Ca 2+ у подоцитах (6) фракції декапсульованих клубочків завантажували Fluo-8 (2,5 мкг/мл, AAT Bioquest) або комбінацією фура червоного та флюо-4 (по 5 мкМ кожен, Invitrogen ) AM барвники з інкубацією на обертовому шейкері для

40 хв при кімнатній температурі. Після цього суспензію клубочків переносили на покривні з полілілізину покриття, давали закріпитися протягом 5–10 хв і двічі промивали PSS для видалення решти барвника. Записи візуалізації Ca 2+ проводили в PSS за допомогою системи конфокального мікроскопа Nikon A1-R. Для оцінки ефекту ферментативної попередньої обробки на АТФ-індуковану відповідь Ca 2+ у подоцитах, зрізи нирок щурів попередньо обробляли ферментами протягом 20 хв перед процедурою вібродисоціації. Для аналізу даних були використані ImageJ та GraphPad Prizm 8.

Статистичний аналіз.

Результати виражаються як середнє значення ± SE. Дані перевіряли на нормальний розподіл, а групи порівнювали за допомогою Стьюдента т-тест.

На відміну від інших методів, що використовуються для отримання об'ємної фракції ниркових канальців, техніка вібродисоціації дозволяє безпосередньо ізолювати тканину із заздалегідь визначеного місця в нирках, що робить цей метод корисним для вестерн-блот, протеомічних та геномних досліджень. Для оцінки придатності розробленого методу для таких досліджень канальці та клубочки, виділені від 1-місячних щурів, були виявлені морфологічно під стереомікроскопом та розділені вручну на фракціях. Кількісні експерименти RT-PCR із використанням специфічних маркерів різних сегментів нефрону виявили, що чистота отриманих фракцій становила> 85% (рис. 2).

Рис.2.Кількісний RT-PCR аналіз клубочків та фракцій ниркових канальців, отриманих від 1-місячних щурів. Котранспортер Na + -глюкози 2 (SGLT2) використовували як маркер проксимальних звивистих канальців (РСТ). Na + -K + -Cl - -транспортер 2 (NKCC2) використовували як маркер товстих висхідних кінцівок петлі Генле (TAL). Аквапорин 2 (AQP2) використовували як маркер збірних проток (CD).

Добре встановлено, що ферментативна попередня обробка може впливати на властивості різних мембранних каналів (8). Однак для конкретних протоколів, таких як затискач пластиру на базолатеральній плазматичній мембрані нефронових канальців, ферментативна попередня обробка необхідна для видалення тонкого листка позаклітинного матриксу, щоб забезпечити достатній доступ до клітинної мембрани. Тому ми розглянули доцільність використання вібродисоціації для електрофізіологічних досліджень. Експерименти з патч-фіксацією одноканальної активності проводили на канальцях CCD, виділених від дорослих мишей та нирок щурів (рис. 3, A і B). Малюнок 3A показує базолатеральний струм K +, записаний при різних потенціалах піпетки. Спостережуваний канал мав швидку кінетику затвора і провідність

48 пС, типово для гетеротетрамерів Kir4.1/Kir5.1, екстенсивно експресованих на базолатеральній мембрані ПЗС (15, 16, 20, 21). Малюнок 3A також показав базолатеральний мембранний канал з високою відкритою ймовірністю, провідність

11 пС, а струм зворотний при 0 мВ, що відповідає типовій активності для каналів Cl - ClC-K2 у ПЗС (21, 24). Малюнок 3B показує приклад діяльності ENaC (

9,5 пС), записаних на розкритих ПЗЗ, видалених з нирки щура, за допомогою методу вібродіссоціації у поєднанні з ферментативною попередньою обробкою. У наших експериментах середня відкрита ймовірність ENaC становила 0,41 ± 0,06 (n = 8), що суттєво не відрізнялося від даних, представлених у механічно ізольованих ПЗЗ (0,34 ± 0,07, n = 7, P = 0,4) (7).

Метод вібродисоціації з ферментативною попередньою обробкою або без неї також може бути використаний для виділення декапсульованих клубочків з добре збереженими подоцитами. Свіжоізольовані клубочки з або без ферментативної ізоляції завантажували флуоресцентними індикаторами Ca 2+ і використовували для конфокального зображення АТФ-індукованої відповіді Ca 2+ у подоцитах щурів (рис. 3C.). Аналіз отриманих даних показав, що інкубація зрізів нирок протягом 20 хв у ферментативному розчині перед поділом клубочків суттєво впливала на АТФ-індуковану відповідь Ca 2+ у подоцитах (P = 0,02), що свідчить про те, що лікування ферментами може суттєво впливати на пуринергічну передачу сигналів та/або приплив Са 2+ в подоцитах.

Нарешті, метод вібродисоціації був використаний для експериментів з фізіології нирок людини. Малюнок 4A показує приклад одноканальної активності, записаної в прикріпленому до клітини режимі від базолатеральної мембрани ПЗС людини при різних мембранних потенціалах. Аналіз біофізичних властивостей показав, що зареєстрований струм опосередковувався активацією гетеромерних каналів Kir4.1/Kir5.1 з провідністю 54 пС (див. Рис. 3A для порівняння з русловою активністю гризунів). Малюнок 4B показує одноканальну поточну активність в апікальній мембрані головних клітин розщепленого відкритого ПЗЗ людини. Статистичний аналіз (3 записи з 3 нирок людини) показав, що електрофізіологічні властивості та провідність 8,77 ± 0,34 пС спостережуваних струмів подібні до активності ENaC в ізольованих канальцях гризунів або людських ENaC у гетерологічних системах експресії (5, 13, 17–19).

Малюнок 4C. показує, що метод вібродисоціації також підходить для ізоляції людських клубочків. Малюнок 4C., правильно, показана середня перехідна реакція Са 2+ на АТФ у подоцитах людського клубочка, виділених без ферментативної попередньої обробки та завантажених флуоресцентними індикаторами флюоро-4 та фура червоного. Ці дані демонструють, що вібродисоціація може бути використана для виділення добре збережених клубочків, придатних для ex vivo фізіологічних та фармакологічних досліджень в людських подоцитах.

Загалом, метод вібродисоціації пропонує новий та зручний підхід до виділення та вивчення сегментів нефрона. На відміну від сучасних методів, призначених для виділення різних компонентів нирки, розроблений підхід дозволяє отримати велику кількість клубочків та ниркових канальців у заздалегідь визначеній ділянці нирки за кілька хвилин. Використання інкубаційної камери з насиченим розчином вуглецю розчином дозволяє зберегти життєздатні зрізи нирок протягом експериментальної доби, що, безсумнівно, важливо для оптимального використання експериментальних тварин та нирок людини. Крім того, розроблений метод дозволяє легко встановлювати банки чистих фракцій різних сегментів нефрону в лабораторних умовах для подальших досліджень молекулярної біології. Ми також показуємо, що техніку вібродисоціації можна використовувати для електрофізіологічних досліджень або зображень Ca 2+ на сегментах нефрону, виділених від різних видів, включаючи людей, оскільки розроблений протокол може бути адаптований до тканин, отриманих при трансплантації нирки та матеріалі біопсії.

За допомогою цього методу ми вперше змогли описати електрофізіологічні властивості каналів K + та Na +, виражені в клітинах збірних проток людини. Крім того, ми оцінили зміни внутрішньоклітинного Са 2+ у відповідь на АТФ у подоцитах зі свіжоізольованих клубочків гризунів за наявності або відсутності ферментативного лікування.

Таким чином, метод вібродисоціації являє собою універсальний та надійний спосіб відокремлення добре збережених сегментів нефрону від різноманітних видів тварин, що вдосконалює сучасні методології виділення компонентів нирок та забезпечує чудову платформу для оцінки їх властивостей у in vitro. Ми віримо, що ця методологія буде неоціненною для перевірки моделей тварин на молекулярному рівні та допоможе подолати розрив у нашому розумінні різноманітності функції нирок між видами.

Цю роботу підтримали Гранти Національного інституту серця, легенів та крові R35-HL-135749 (А.Старущенку), P01-HL-116264 (А.Старущенку) та T32-HL-134643 (CA CA Klemens) стипендію Центру серцево-судинних захворювань А.О.

Ніяких конфліктів інтересів, фінансових чи інших, автор не заявляє.

E.I., O.P. та A.S. задумані та спроектовані дослідження; E.I., M.F., R.B., C.A.K., S.K., D.G., V.L. та O.P. проводили експерименти; E.I., M.F., R.B., C.A.K., D.G., V.L. та O.P. аналізували дані; E.I., A.E.-M., O.P. та A.S. інтерпретовані результати експериментів; E.I., M.F., R.B., C.A.K., S.K., O.P. та A.S. підготовлені фігури; Е.І. і як. складений рукопис; E.I., C.A.K., A.E.-M., O.P. та A.S. відредагований та перероблений рукопис; E.I., M.F., R.B., C.A.K., S.K., D.G., V.L., A.E.-M., O.P. та A.S. затверджена остаточна версія рукопису.

ЛІТЕРАТУРА

ПРИМІТКИ АВТОРА

* Є. Ісаєва та М. Федорюк однаково сприяли цій роботі.

Адреса для запитів на передрук та іншої кореспонденції: А. Старущенко, кафедра фізіології, Медичний коледж штату Вісконсін, 8701 Watertown Plank Rd., Мілуокі, штат Вісконсин 53226 (електронна пошта: [електронна адреса захищена] edu).