Лептин діє на обмін речовин залежно від періоду, але не впливає на репродуктивну функцію сибірського хом’яка (Phodopus sungorus) *

Ця робота була підтримана грантом на дослідження, присудженим компанії A.S.I.L. та FRAC Радою з досліджень біотехнологій та біологічних наук (Сполучене Королівство) та доктором наук, що підтримується Радою з досліджень біотехнологій та біологічних наук. студентство (до Z.A.), також частково підтримане Центральною токсикологічною лабораторією AstraZeneca (Чешир, Великобританія).

Перші два автори зробили однаковий внесок у це дослідження.

Зеенат Атча, Феліно Рамон А. Кагампанг, Дж. Енн Стірланд, Ян Д. Морріс, А. Найджел Брукс, Френсіс Дж. Еблінг, Мартін Клінгенспор, Ендрю С.І. про репродуктивну функцію у сезонно розмножуваного сибірського хом'яка (Phodopus sungorus)

Ця робота була підтримана грантом на дослідження, присудженим A.S.I.L. та FRAC Радою з досліджень біотехнологій та біологічних наук (Сполучене Королівство) та доктором наук, що підтримується Радою з досліджень біотехнологій та біологічних наук. студентство (до Z.A.), також частково підтримане Центральною токсикологічною лабораторією AstraZeneca (Чешир, Великобританія).

Анотація

У сезонних ссавців, таких як сибірський хом'як, регульовані фотопериодом зміни в розмноженні пов'язані з основними сезонними циклами метаболізму та споживання їжі. Ці метаболічні ритми зберігаються у кастрованих тварин і тому не залежать від змін у статевих залозах статевих залоз (1, 2). У довгі дні (ЛД) маса тіла збільшується за рахунок підвищеного апетиту та відкладення жиру в організмі, але після дії коротких днів (СД) тварина демонструє зниження апетиту і проходить тривалий 20-тижневий період схуднення (25 –30%), майже повністю у вигляді виснажених запасів жиру в черевній порожнині (1). У тварин, які піддаються дії коротких фотоперіодів та одночасно обмеженого харчування протягом тривалого періоду, ця швидкість втрати ваги прискорюється. Однак при відновленні довільної годівлі тварини відновлюють вагу, але лише до того моменту в циклі схуднення, якого вони, як правило, досягли б одночасно за умов довільного годування в SD (3). Це типово явище сезонного ковзання заданого значення для регулювання маси тіла (= жиру), за допомогою якого фотоперіод змінює ті механізми, що беруть участь у захисті певної маси тіла, незалежно від короткочасних маніпуляцій з прийомом їжі та енергетичним балансом.

Лептин, продукт гена OB, отриманого з жирової тканини, був причетний до ряду основних периферичних сигналів, що контролюють запаси жиру та апетит у ссавців (4). Як відомо, центральна нервова система, зокрема гіпоталамус, є основним місцем дії лептину, і саме тут активна форма рецептора лептину колокалізується в пептидергічні ланцюги, безпосередньо задіяні в енергетичному балансі (5). В даний час визнано, що лептин також може відігравати важливу роль у регуляції репродуктивної функції. Мутації цього гена призводять до первинного ожиріння та репродуктивної дисфункції у людини та мишей (6, 7), які обидва змінюються після лікування рекомбінантним мишачим лептином (7–9). У сибірського хом'яка на експресію гена лептину як у білій, так і в коричневій жировій тканині сильно впливає фотоперіод із 6-кратним зменшенням експресії за короткі дні (10). Ці спостереження піднімають важливі питання щодо того, яку роль можуть відігравати сезонні зміни в сигнальному шляху лептину в регуляції річного циклу метаболізму та розмноження.

Матеріали і методи

Тварини

Всі процедури на тваринах були ліцензовані відповідно до Закону про тварини (про наукові процедури) 1986 р., Великобританія. Дослідження проводили на сибірських хом'ячках (Phodopussungorus; Wright's of Essex, Челмсфорд, Великобританія) з колонії, виведеної в Університеті Манчестера і отриманої на тваринах, описаних раніше (11). Тварин утримували в контрольованих умовах (температура, 21 ± 1 С; вологість, 80%) і забезпечували їх чау-гривом (Special Diet Service, Witham, Великобританія) та водою ad libitum. Експериментальних тварин індивідуально розміщували в контрольованих світлом екологічних камерах, освітлених 70-ватною флуоресцентною білою смугою (100–400 люкс) з безперервним тьмяним червоним світлом (м PBS) і вводили через осмотичний міні-насос (ємність 100 мкл; модель Alzet 1007D Charles River Laboratories UK Ltd., Кент, Великобританія) для доставки концентрації 15 мкг/день протягом 7-денного періоду. Контрольні тварини отримували лише транспортний засіб PBS. Насоси імплантували sc в область лопатки стерильною хірургічною процедурою під галотаном (Fluothane, AstraZeneca Ltd., Чешир, Великобританія) анестезія.

Експериментальні протоколи

Досвід 2: встановлення моделі стероїдного затиску у самців хом'яків, що одержують яйця. Чотирнадцяти тижневих жіночих хом'яків, виведених в умовах LD, овариектомизировали (OVX) і через 2 тижні імплантували sc в область лопатки імплантатом, що містить естрадіол (E2). Виробництво імплантатів Е2 було описано раніше (14). Коротко кажучи, імплантати виготовляли шляхом змішування ряду доз естрогену (1,3,5 [10] -естратрієн-3,17β-діол; Sigma-Aldrich Corp. Ltd., Дорсет, Великобританія) з еластомером марки SILASTIC та затверджувачем (Merck Ltd., Дорсет, Великобританія) для полімеризації еластомеру. Після затвердіння імплантати вирізали до квадратів 4 × 4 мм і містили розрахункові дози естрогену 0, 31, 62, 125, 250 та 500 мкг/імплантат. Всього було використано шість тварин на дозу та порівняно з групою з шести інтактних контролерів. Через три тижні після імплантації тварин винищували при вивиху шийки матки та зважували парні знежирені матки.

Щоб визначити фотоперіодичний привід на секрецію ЛГ у кастраті, імплантована стероїдами модель, подальшу когорту 16-тижневих самок було розділено на три групи. Їх овариектомизировали і обробляли порожнім імплантатом (OVX), овариектомизировали і імплантували з найменшою (31 мкг) дозою E2 (OVX + E2), або залишали цілими і обробляли порожнім імплантатом (INT). Усі тварини були розміщені індивідуально під SD-або LD-періодом (по шість на обробку за фотоперіод) через 2 тижні після операції, а протягом наступних 12 тижнів проводились щотижневі вимірювання маси тіла, споживання їжі та оцінки пелажу для підтвердження відповіді на SD-фотоперіод. . Наприкінці 12-го тижня тварин вбивали, а гіпофіз швидко розсікали, заморожували в сухому льоду і зберігали при -80 С перед аналізом ЛГ. Парні маточні та заочеревинні жирові депо розсікали та зважували. Описані вище імплантати 31 мкг були використані у всіх наступних експериментах.

Досвід 3: Інфузія лептину у хом'яків, затиснутих стероїдами, у LD та SD. Двадцять чотири тижні, імплантовані OVX, стероїдними імплантованими 16-тижневими хом'ячками, раніше вирощуваними в LD, були розміщені в індивідуальному порядку та піддані впливу LD або SD протягом 8 тижнів. Щотижневі вимірювання маси тіла, споживання їжі та показника пелажу проводились протягом 0–8 тижнів. На 9–11 тижнях кожна тварина отримувала осмотичний насос, що містив або лептин, або PBS, як описано вище (по шість тварин на групу на обробку). Насоси замінювали через 1 тиждень протягом наступного 1-тижневого періоду. З 9–11 тижнів реєстрували щоденні зміни споживання їжі та маси тіла. 14 дня хом'яків знеболювали, а проби крові відбирали шляхом серцевої пункції для визначення лептину в сироватці крові. Тварин вбивали при вивиху шийки матки, а гіпофіз швидко видаляли, заморожували в сухому льоду і зберігали при -80 ° С перед аналізом ЛГ. Ретроперитонеальні жирові депо та матки розтинали та зважували.

Гомогенізація гіпофіза та аналіз гормонів

Обробка гіпофізів. Кожен гіпофіз гомогенізували протягом 2 хв у 50-метровому розчині карбонату натрію (рН 7,4), що містить 1% Тритон-Х 100, а потім залишали стояти протягом 30 хв. Аліквоту 50 мкл видаляли для визначення білка гіпофіза методом Бредфорда (15). Залишився гомогенат центрифугували при 10000 × g протягом 30 хв, і супернатант збирали для визначення концентрації LH.

LH. Для визначення концентрації ЛГ в гіпофізі використовували подвійну антитіло RIA, як описано раніше для використання у хом'яків (16). Реагенти RIA постачались Національною програмою з питань гормонів та гіпофіза (NIDDK, Bethesda, MD) та використовували антитіло до LH кролячого антирата S-11 та референтний препарат LH RP-3 щура. Середня мінімально виявлена концентрація ЛГ у гомогенаті гіпофіза становила 0,156 нг/мл, а коефіцієнти варіації внутрішньо- та міжаналітичного аналізу становили 4% та 17% для пулів гомогенатів при 2,8 та 1,4 нг/мл відповідно. Розведення гіпофіза протягом 16 разів (1: 8–1: 128) демонструвало чіткий паралелізм (дані не наведені). Концентрацію LH перетворили на нанограми LH на мкг концентрації білка гіпофіза. Ми не проводили аналіз рівня ЛГ у сироватці крові, оскільки нас обмежував обсяг сироватки, необхідний для аналізу лептину.

Тестостерон. Рівні тестостерону в сироватці крові визначали за допомогою імуноферментного аналізу, як описано для використання у цього виду (17). Всі зразки були включені в один аналіз. Ефективність екстракції становила 81%, а межа виявлення становив 0,05 нг/мл. Коефіцієнт варіації внутрішньопробного аналізу на основі повторностей сироваткового пулу становив 12,9%.

Лептин. Концентрації лептину в сироватці крові визначали твердофазним імуноферментним аналізом із використанням очищеного за спорідненістю кролячого антирекомбінантного мишачого лептину, іммобілізованого в лунках мікротитру (18). Зв’язаний лептин виявляли за допомогою спорідненого очищеного антимуринового поліклонального антитіла, кон’югованого з пероксидазою хрону, і кількісно визначали хромогенною речовиною. Концентрації лептину розраховували за стандартними кривими, сформованими для кожної мікротитраційної пластини, використовуючи рекомбінантний мишачий лептин. Межа виявлення для аналізу становила 0,15 нг/мл, а коефіцієнти варіації внутрішньо- та міжвипробувань становили 4,5% та 8% відповідно, визначені з внутрішнього контролю мишачого лептину. Через гетерологічну природу стандартів лептину, виміряні концентрації лептину в сироватці крові є відносними та не обов'язково абсолютними. Зразки сироватки завжди аналізували у трьох розведеннях у двох примірниках і з двома розведеннями, які зазвичай потрапляли в діапазон стандартної кривої. Порівняння розрахункових концентрацій двох розведень від кожного хом'ячка показало, що значення варіювали одне від одного не більше ніж на 13%.

Аналіз даних

Параметричні дані аналізували ANOVA з подальшим тестом Стьюдента-Ньюмена-Кілса. Непараметричні дані аналізували за допомогою тесту Крускала-Уолліса з подальшим тестом Тукі. Часові реакції аналізували шляхом повторних вимірювань ANOVA. Всі аналізи проводились із використанням статистичного пакету (SigmaStat, SPSS, Chicago, IL). Результати представлені як середнє значення ± sem. Різниці вважали статистично значущими на рис. 1). У подальшому дослідженні з використанням дози 31 мкг концентрація ЛГ в гіпофізі суттєво модулювалася за періодом фотографії (Р = 0,018, за допомогою двосторонньої ANOVA). У тварин OVX, які піддавались LD, був значний (P рис. 2). Всі групи тварин SD виявляли стійку фотопериодичну реакцію втрати ваги (P Рис. 3. Був значний вплив як фотоперіоду, так і лікування естрогеном на масу тіла (photoperiod, P = 0,003; estrogen, P sem. *, P sem. *, P sd (▪) фотоперіоди. Значення - це середнє значення ± sem. *, P sd (▪) фотоперіоди. Значення є середнім значенням ± sem. *, P sem.

Вплив фотоперіоду LD або SD на щотижневе споживання їжі (верхні панелі) та масу тіла (нижні панелі) у хом'яків INT, OVX та OVX + E2 (n = 6/група). Значення - це середнє значення ± sem.

Концентрація лептину в сироватці крові

Вплив 14-денного лікування лептином (□) на масу яєчок (a) та тестостерон (b) у сироватці крові у самців хом'яків, що утримуються або у фотопериодах SD, або LD. Значення - це середнє значення ± sem.

Вплив 14-денної терапії лептином (□) на концентрацію ЛГ у гіпофізі у хом'яків самців (a) та OVX + E2 (b) у хом'яків, що утримуються як у SD, так і у LD періодах. Значення - це середнє значення ± sem.

Обговорення

Наші дані показують, що сезонний фотопериодичний цикл апетиту та ваги сибірського хом'яка пов’язаний зі значними змінами виміряних концентрацій лептину в сироватці крові, які відслідковують зміни у внутрішньочеревних жирових депо. Повідомлені тут змінні обміну речовин та секреції лептину, опосередковані фотоперіодом, спостерігаються як у жінок, затиснутих стероїдами, так і у чоловіків, що не порушують статеві залози, і тому їх слід розглядати як незалежні від сезонних змін рівня статевих стероїдів. Цікаво, що утримувані стероїдами затиснуті у SD тварини демонстрували початковий період набору ваги за 2–3 тижні до втрати ваги, на відміну від жінок-кастратів, які втрачали вагу протягом усього періоду впливу SD. Ми пояснюємо це можливим анаболічним ефектом дози естрогену, що застосовується у тварин, затиснутих стероїдами.

Таким чином, наші дані демонструють чіткі фотопериодичні відмінності в метаболічній реакції сибірських хом'яків на інфузію лептину, які не залежать від пригнічення прийому їжі, що означає пряму дію цього гормону на термогенез та енергетичні витрати. Нездатність цього гормону реактивувати фотоінгібовану репродуктивну вісь настійно наводить на думку, що шляхи, що беруть участь у сезонному придушенні розмноження за допомогою сигналу мелатоніну, відрізняються від шляхів, пов'язаних з проксимальними реакціями на короткочасну подачу поживних речовин і зворотний зв'язок з лептином.

Подяка

Автори висловлюють подяку Марджері Ніколсон та колегам з Amgen, Inc. за постачання лептину та RIA для визначення концентрації лептину, Національну програму з гормонів та гіпофіза (Bethesda, MD) за надання реагентів LH RIA та доктора Річарда Преціозі для статистичних даних. порада.